本文介紹一下用勻漿器研磨法提取貼壁細(xì)胞核蛋白的具體操作。

一,、前期準(zhǔn)備

1,、臺(tái)盼藍(lán)染液：

取臺(tái)盼藍(lán)粉劑，將其溶解在10mL的雙蒸水當(dāng)中配制成質(zhì)量體積比為4%（4%w/v）的臺(tái)盼藍(lán)母液,。在使用時(shí),，利用PBS緩沖液將母液稀釋10倍,，使其濃度達(dá)到0.4%，之后再與細(xì)胞懸液混合均勻,。

2,、BufferA：

包含10mmol/L的HEPES（在4℃下pH值為7.9）、1.5mmol/L的氯化鎂,、10 mmol/L的KCL,、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）。若擔(dān)心漿蛋白降解會(huì)對(duì)核蛋白產(chǎn)生影響,，可以添加1mmol/L的PMSF,。

3、BufferB：

含有20mmol/L的HEPES（pH值為7.9）,、體積分?jǐn)?shù)為25%的甘油,、0.42mol/L的氯化鈉、1.5mmol/L的氯化鎂,、0.2mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）,、0.5mmol/L的PMSF、0.5mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）,。

二,、具體步驟

1、使用胰酶將貼壁細(xì)胞消化下來,，把這些細(xì)胞收集到1.5mL EP管中,。4℃以300g的離心力離心5min。離心完成后,，用PBS緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌(2次),。

2、棄上清,，加入體積為細(xì)胞沉淀5倍的預(yù)冷Buffer A（每20μL的細(xì)胞沉淀加入100μL的Buffer A）,，之后輕輕吹打，使細(xì)胞在Buffer A中重新懸浮,。

3,、將上述細(xì)胞懸浮液在冰上放置10min，隨后再次在4℃條件下,，以300g的離心力離心5min,。離心結(jié)束后，加入體積為其25倍的預(yù)冷Buffer A,，并通過吹打操作讓細(xì)胞重新懸浮,。

4、把經(jīng)過上述處理后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移勻漿器中,，準(zhǔn)備進(jìn)行勻漿操作,。

5,、在勻漿過程中，取出少量的細(xì)胞懸液,，與等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液混合均勻,，接著在顯微鏡下觀察細(xì)胞的破膜情況。如果觀察到大部分細(xì)胞都被染成了藍(lán)色,，就停止勻漿操作,；要是大部分細(xì)胞未被染成藍(lán)色，則繼續(xù)進(jìn)行勻漿,。

6,、當(dāng)大部分細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中,，然后在4℃環(huán)境下,，以25000g的離心力離心20min。

7,、離心結(jié)束后,，現(xiàn)在上清液中包含的是細(xì)胞裂解物中的胞漿成分，沉淀部分則是核蛋白,。

8,、收集離心后的沉淀,，向其中加入與沉淀等體積的預(yù)冷Buffer B,，然后輕輕地吹打，使沉淀呈現(xiàn)懸浮狀態(tài),。接著將懸浮液轉(zhuǎn)移到干凈的組織勻漿器中,，以均勻的力度進(jìn)行30次勻漿操作。

9,、把經(jīng)過勻漿的懸浮液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中,，放在冰上的低速搖床上振蕩45min。

10,、在4℃條件下,，以25000g的離心力離心30min，收集得到的上清液即為細(xì)胞核蛋白

11,、提取核蛋白后,，可使用一些核蛋白（如H3蛋白、Lamin蛋白）作為對(duì)照蛋白,，進(jìn)行WB驗(yàn)證,。

注：全部步驟均需于冰上操作。

伊萊瑞特蛋白代理,、OriGene蛋白代理,、Proteintech蛋白代理,、Advanced BioMatrix蛋白代理——天津益元利康生物科技有限公司。