上文介紹了流式細胞術(shù)的原理及應用,今天讓我們學習一下怎么用流式細胞儀分選T細胞吧~
一,、樣本制備
1.取樣: 取100μL抗凝血,。
2.標記:根據(jù)抗體說明書標記實驗管?;靹蚝?,室溫避光孵育15分鐘。
3. 溶血:將10×裂紅液用水稀釋10倍,,每管加入1mL,,振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘,300g,,4°C離心5分鐘,。
4. 洗滌:棄去上清,加入1mL 1×PBS洗液,,300g離心洗滌5分鐘,,洗2-3次。
5. 上機檢測:棄去上清后加入500μL 1×PBS,,混勻懸浮后過濾,,避光等待上機檢測。
二,、儀器操作
1. 打開流式細胞儀,、開啟液流、質(zhì)控,。
2. 分選前設(shè)置:共包含兩個步驟,,第一,調(diào)節(jié)合適的液流斷點,,待四路窗口形成清晰的5路液流,,其中含4個收集液流,一個廢液流后,,利用“sweetspot”鎖住此斷點,;然后利用Accudrop 珠子,,調(diào)整 “Drop Delay”時間,當左側(cè)液流接近 100%,,而且保持相對穩(wěn)定的范圍的時間是最佳時間,。
3. 設(shè)置分析條件:完成質(zhì)控后,建立用戶文件夾,、當日實驗文件夾,,根據(jù)細胞標記,選擇所需參數(shù),,根據(jù)各抗原之間生物關(guān)系及實驗主要關(guān)注點,,畫好 FSC-SSC及各熒光參數(shù)兩兩相對的散點圖,根據(jù)抗原生物關(guān)系設(shè)置分析門,,及群級聯(lián)關(guān)系表,。
4. 確定電壓:先上對照管,根據(jù)淋巴細胞在 FSC-SSC散點圖中的位置,,調(diào)整 FSC和SSC兩個參數(shù)的電壓,,保證淋巴、單核及中心粒細胞呈現(xiàn)在合適的位置,,然后設(shè)置P1 門圈住淋巴細胞,;根據(jù)陰性細胞群位置,調(diào)整好其它熒光參數(shù)的電壓,,記錄10000個細胞,。
5. 分類計數(shù):上陽性管,通過分級設(shè)門,,完成各抗原之間生物關(guān)系的呈現(xiàn),,及各細胞分類計數(shù)情況。
6. 分選設(shè)置:在“sort layout”窗口,,設(shè)置收集裝置和純度模式,,然后設(shè)置分選門,圈住CD4或CD8 陽性的細胞,,將分選門分別填入左右“sort location field” 框中,。
7. 分選:將收集管中分別裝200ul 1XPBS,放入儀器分選倉下面的收集管架上:點“sort”開始分選,,此時“sort location field”框中可見所獲得的CD4或CD8陽性的細胞數(shù)目,;收集到足夠的目的細胞后,停止分選,。
8.細胞純度檢測:利用上樣針清洗液和水清洗上樣針,,直到以水上樣時,FSC-SSC散點圖中“無點”為止。將分選獲得的CD4陽性細胞上樣回測,,觀察細胞分選純度,;再次清洗上樣針,將分選獲得CD8陽性細胞上樣回測,,觀察細胞分選純度,。
通過以上實驗步驟,我們可以成功分選并收集到特定的T細胞群體,。
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