上文介紹了流式細胞術(shù)的原理及應用，今天讓我們學習一下怎么用流式細胞儀分選T細胞吧~

一,、樣本制備

1.取樣: 取100μL抗凝血,。

2.標記：根據(jù)抗體說明書標記實驗管?；靹蚝?，室溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血：將10×裂紅液用水稀釋10倍,，每管加入1mL,，振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘，300g,，4°C離心5分鐘,。

4. 洗滌：棄去上清，加入1mL 1×PBS洗液,，300g離心洗滌5分鐘,，洗2-3次。

5. 上機檢測：棄去上清后加入500μL 1×PBS,，混勻懸浮后過濾,，避光等待上機檢測。

二,、儀器操作

1. 打開流式細胞儀,、開啟液流、質(zhì)控,。

2. 分選前設(shè)置：共包含兩個步驟,，第一，調(diào)節(jié)合適的液流斷點,，待四路窗口形成清晰的5路液流,，其中含4個收集液流，一個廢液流后,，利用“sweetspot”鎖住此斷點,；然后利用Accudrop 珠子,，調(diào)整 “Drop Delay”時間，當左側(cè)液流接近 100%,，而且保持相對穩(wěn)定的范圍的時間是最佳時間,。

3. 設(shè)置分析條件：完成質(zhì)控后，建立用戶文件夾,、當日實驗文件夾,，根據(jù)細胞標記，選擇所需參數(shù),，根據(jù)各抗原之間生物關(guān)系及實驗主要關(guān)注點,，畫好 FSC-SSC及各熒光參數(shù)兩兩相對的散點圖，根據(jù)抗原生物關(guān)系設(shè)置分析門,，及群級聯(lián)關(guān)系表,。

4. 確定電壓：先上對照管，根據(jù)淋巴細胞在 FSC-SSC散點圖中的位置,，調(diào)整 FSC和SSC兩個參數(shù)的電壓,，保證淋巴、單核及中心粒細胞呈現(xiàn)在合適的位置,，然后設(shè)置P1 門圈住淋巴細胞,；根據(jù)陰性細胞群位置，調(diào)整好其它熒光參數(shù)的電壓,，記錄10000個細胞,。

5. 分類計數(shù)：上陽性管，通過分級設(shè)門,，完成各抗原之間生物關(guān)系的呈現(xiàn),，及各細胞分類計數(shù)情況。

6. 分選設(shè)置：在“sort layout”窗口,，設(shè)置收集裝置和純度模式,，然后設(shè)置分選門，圈住CD4或CD8 陽性的細胞,，將分選門分別填入左右“sort location field” 框中,。

7. 分選：將收集管中分別裝200ul 1XPBS，放入儀器分選倉下面的收集管架上：點“sort”開始分選,，此時“sort location field”框中可見所獲得的CD4或CD8陽性的細胞數(shù)目,；收集到足夠的目的細胞后，停止分選,。

8.細胞純度檢測：利用上樣針清洗液和水清洗上樣針,，直到以水上樣時，FSC-SSC散點圖中“無點”為止。將分選獲得的CD4陽性細胞上樣回測,，觀察細胞分選純度,；再次清洗上樣針，將分選獲得CD8陽性細胞上樣回測,，觀察細胞分選純度,。

通過以上實驗步驟，我們可以成功分選并收集到特定的T細胞群體,。

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