20世界90年代由美國(guó)Applied Biosystems公司推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time qPCR），其基本原理是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光染料探針,，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程,。熒光定量PCR最大的優(yōu)勢(shì)可以對(duì)初始模板進(jìn)行定量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué),、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一旦遇到?jīng)]有Ct值情況，就要在第一時(shí)間排查是否有以下問題：

在相對(duì)定量中,，Ct值一般控制在15~25之間比較好,，如果在絕對(duì)定量中，對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,，Ct值會(huì)增大,，但是一般不宜超過40循環(huán)，否則定量不準(zhǔn)確,。因此,，判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行,。

如果遇到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳R²<0.9）的情況，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣存在誤差,，吸樣不準(zhǔn),，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；

（2）標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解,。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融,，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃,，不要反復(fù)凍融,，現(xiàn)配現(xiàn)用；

（3）引物或探針不佳,。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針,；

（4）模板中存在抑制物。模板濃度過高,，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求,，一般模板量不超過500ng，以50~500ng為宜,。

如果陰性對(duì)照擴(kuò)增有信號(hào),，首先排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng)，造成交叉污染：

（1）引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化,。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),。

（2）引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度,，并注意上下游引物的濃度配比,。

（3）鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度,，或選擇更適合的mix試劑盒,。

（4）模板有基因組的污染,。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增,。

（5）交叉污染,。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染,，建議對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行處理,，或者更換新的環(huán)境,、加樣器,、槍頭以及所有的引物、試劑等,。

如果熔解曲線峰不特異,，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

（1）引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),，這是最主要因素,；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時(shí),，適當(dāng)降低引物濃度,，并注意上下游引物的濃度比例；

（2）離子濃度不合適,。適當(dāng)降低鎂離子濃度,，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合,，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果,；

（3）模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增,。

該情況適用于針對(duì)所有的基因，特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴(kuò)增信號(hào)時(shí),，應(yīng)考慮如下情況：

（1）反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳,，另外考慮熒光染料是否降解；

（2）反應(yīng)條件不夠優(yōu)化,?？蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法，適當(dāng)延長(zhǎng)變性退火時(shí)間,；

（3）反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物,。一般是加入模板時(shí)所引入的，應(yīng)先把模板適度稀釋,，再加入反應(yīng)體系,，減少抑制物的影響,。

如果遇到擴(kuò)增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況,，那么很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

參考文獻(xiàn)：

Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits （EUROGENTEC）