多光子激光掃描顯微鏡（Multiphoton Laser Scanning Microscopy,，簡稱MPLSM）是一種先進的光學顯微技術(shù),，它利用兩個或多個光子同時被樣品吸收的非線性光學過程來激發(fā)熒光，從而實現(xiàn)對生物樣品深層結(jié)構(gòu)的高分辨率成像,。與傳統(tǒng)的光學顯微鏡相比,，多光子顯微鏡具有更深的穿透力、更少的光毒性以及更高的空間分辨率等優(yōu)點,，特別適用于活體細胞和組織的長時間觀察,。

原理

多光子顯微鏡的核心原理是多光子吸收。在傳統(tǒng)的單光子激發(fā)中,，一個高能量的光子被熒光分子吸收,，激發(fā)熒光。而在多光子吸收中,，兩個或多個低能量的光子幾乎同時被同一個熒光分子吸收,，其總能量相當于一個高能量光子的能量，從而激發(fā)熒光,。這一過程通常發(fā)生在激光聚焦點處,，因此具有很高的空間選擇性。

關(guān)鍵組件

多光子顯微鏡的關(guān)鍵組件包括：

激光器：通常使用飛秒脈沖激光器,，因為其短脈沖寬度可以提供高能量密度,，有利于多光子吸收過程。

掃描系統(tǒng)：包括掃描鏡和光路系統(tǒng),，用于控制激光束在樣品上的掃描路徑,。

探測器：用于收集樣品發(fā)出的熒光信號,，并將其轉(zhuǎn)換為電信號，最后形成圖像,。

光學元件：如物鏡,、分光器等,，用于聚焦激光和收集熒光,。

優(yōu)勢

多光子顯微鏡相較于其他顯微技術(shù)具有以下優(yōu)勢：

深層成像能力：由于使用的是紅外光，其散射和吸收較小,，因此可以實現(xiàn)對樣品較深層結(jié)構(gòu)的成像,。

減少光毒性：由于激發(fā)僅限于激光聚焦點，減少了對樣品的光損傷和光毒性,，適合長時間觀察活體細胞,。

提高分辨率：多光子激發(fā)的熒光僅在焦點處產(chǎn)生，因此具有天然的光學切片能力,，可以實現(xiàn)三維成像,。

減少背景信號：由于激發(fā)僅限于焦點處，因此背景信號較低,，提高了圖像的對比度,。

應用

多光子顯微鏡在生物醫(yī)學研究領域有著廣泛的應用：

神經(jīng)科學：用于觀察活體大腦中的神經(jīng)元活動和神經(jīng)網(wǎng)絡。

腫瘤學：研究腫瘤微環(huán)境和血管新生,。

發(fā)育生物學：觀察胚胎發(fā)育過程中的細胞動態(tài),。

免疫學：研究免疫細胞在組織中的行為。

結(jié)論

多光子激光掃描顯微鏡是一種強大的成像工具,，它通過多光子吸收原理,，克服了傳統(tǒng)顯微鏡的局限性，為生物醫(yī)學研究提供了新的視角,。其在深層成像,、減少光毒性、提高分辨率等方面的優(yōu)勢,，使其成為研究活體組織和細胞的技術(shù)之一,。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，多光子顯微鏡將在未來的科學研究中發(fā)揮更加重要的作用,。