人抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體（GM1）試劑盒（ELISA）

使用說明書

 Human GM1 ELISA Kit說明書

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體（GM1）的含量,。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

l 本試劑盒僅供科研使用,，不得用于臨床診斷

實驗原理

試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體（GM1）捕獲抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體（GM1）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度,。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測,。

4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,。

需要而未提供的試劑和器材

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

備注：

1.  標(biāo)準品濃度依次為：80、40,、20,、10、5,、2.5 ng/mL

2.  經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗,，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準品濃度時,，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。

注意事項

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用,。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9. 不能使用過期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用,。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2.  設(shè)置標(biāo)準品孔和樣本孔，標(biāo)準品孔各加不同濃度的標(biāo)準品50μL,；

3.  樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。

4.  除空白孔外,，標(biāo)準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5.  棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）,。

6.  每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結(jié)果計算

以所測標(biāo)準品的OD值為橫坐標(biāo),，標(biāo)準品的濃度值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準曲線，并得到直線回歸方程,，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1.  檢測范圍：2.5 ng/mL – 80 ng/mL,。

2.  靈敏度：檢測濃度小于0.1 ng/mL,。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% ,。