本試劑盒用于體外檢測(cè)血清,、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人β半乳糖苷酶（βGAL）的含量,。

實(shí)驗(yàn)原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被人β半乳糖苷酶（βGAL）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人β半乳糖苷酶（βGAL）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度,。

樣本處理及要求：

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè),。

4.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。

需要而未提供的試劑和器材：

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成：

備注：

1.  標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：400,、200、100,、50,、25、12.5 pg/ml

2.  經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi),，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

注意事項(xiàng)：

1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉,。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果,。

6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。

7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品,。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置,。

試劑準(zhǔn)備：

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。

操作步驟：

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.  樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL,；空白孔不加,。

4.  除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6.  每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。

7.  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計(jì)算出樣品的濃度,。

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.  檢測(cè)范圍：12.5 pg/ml – 400 pg/ml。

2.  靈敏度：檢測(cè)濃度小于1.0 pg/ml,。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15%