固相萃?。⊿PE）

SPE是一種功能強大的樣品制備技術(shù),，幾十年來一直用于各種生物樣品中微量分析物的選擇性提取和富集。SPE的作用機制與液相色譜法類似,，它是基于溶解在液體（流動相）中的溶質(zhì)（感興趣的分析物）和吸附劑材料（固定相）之間的親和性或相互作用,。由于物理化學(xué)性質(zhì)的不同，液體樣品中的不同組分在SPE器件的固定相中與吸附劑有不同的親和性或相互作用,。通過SPE,，液體樣品經(jīng)過適當(dāng)處理（稀釋、pH調(diào)整和/或添加IS)后,，裝載到填充適當(dāng)吸附材料的預(yù)處理/平衡柱/筒/板上,；通過不同的吸附材料相互作用（固定相）相互作用被保留；干擾基質(zhì)組件在加載過程中直接通過柱/筒/板,，或在清洗過程中用適當(dāng)?shù)娜軇┣逑?；隨后用合適的洗脫溶劑從柱/筒/板中洗脫感興趣的分析物。收集到的洗脫液要么直接進行LC-質(zhì)譜分析,，要么進行干燥過程以蒸發(fā)有機溶劑,。在LC-質(zhì)譜分析之前,，用適當(dāng)?shù)娜軇┲亟M或開始流動相。使用SPE,，可以預(yù)防或最小化與PPT和/或LLE相關(guān)的一些問題,。這些問題包括但不限于(i)PPT中的基質(zhì)效應(yīng)和（ii）LLE中不wanquan相分離導(dǎo)致的恢復(fù)較差。SPE產(chǎn)品可從各種供應(yīng)商處提供各種化學(xué)物質(zhì),、吸附劑,、尺寸和格式，以適應(yīng)不同的樣品尺寸和生物分析應(yīng)用,。

SPE固定相（吸附劑）

SPE吸附劑材料通常是不規(guī)則形狀的剛性顆粒,，標稱尺寸從8到70μm（最常見的是40-60μm），這允許在加載,、洗滌和洗脫過程中樣品或溶液通過吸附劑床的合理的流速,。SPE吸附材料的較小顆粒需要更高的壓力。例外的是板格式的吸附劑材料,。由于這種格式的床路徑非常短,，由于粒徑小，所產(chǎn)生的總電阻小于格式化成柱或盒的典型吸附床,。大多數(shù)SPE材料在本質(zhì)上是wanquan多孔的,。吸附劑材料的小孔隙率與較高的總表面積有關(guān)，因此,，吸附劑材料的活性吸附容量更高,。通常，SPE吸附劑中給定的吸附劑材料的容量約為每質(zhì)量吸附劑的百分之一（%）保留化合物（例如,，5毫克化合物被100毫克吸附劑保留）,。SPE吸附劑可大致可分為兩大類，即硅基吸附劑和聚合物基吸附劑,。

硅基吸附劑：根據(jù)定義,，硅基吸附劑是通過將不同的官能團與硅結(jié)合而制成的，盡管堿基硅在一些SPE工作流程中也起著積極的作用,。許多商業(yè)上可用的硅基吸附劑都使用首字母縮寫來命名,。這些首字母縮寫描述了二氧化硅上各自官能團的主要特征，包括C18,、C8,、C6、C4,、C2,、苯基、環(huán)己基,、氰丙基,、氨基丙基,、二乙胺,、二醇,、丙基磺酸、苯磺酸,、丙基羧酸和丙基三甲基胺,。基于c18的SPE柱/墨盒/板是非常受歡迎的和最疏水性的,。由于其很強的疏水性,，它們對許多化合物具有很強的保留性。然而,，它可能不能提供好的選擇性,。為了在SPE中獲得更好的選擇性，可以使用疏水相較少的SPE柱/墨盒/板,，如c8柱,，這也非常流行。

無論在制造硅基SPE吸附劑時使用哪種鍵化學(xué),，由于結(jié)合官能團的空間因素,，殘留在吸附劑表面的未反應(yīng)（或殘留的）硅醇種類的數(shù)量仍然很高（典型的c18鍵相的>50%）。這些硅醇物種能夠與分析物分子相互作用,，往往導(dǎo)致意外的保留效應(yīng)和較低的提取效率,。在溶液的pH ~4中，硅表面約50%的硅醇被電離,。因此,，可以調(diào)整溶液pH，以確保硅烷醇物種的離子抑制（pH≤2）或wanquan電離（pH≥6）,。需要注意的是,，當(dāng)暴露在jiduanpH中時，硅吸附劑可能會被水解,。在pH值為2時,，鍵合表面易于水解，吸附劑的效率可以大大降低,。在pH值為8時,，二氧化硅本身易于水解，吸附劑在長期暴露后迅速惡化,。

聚合物基吸附劑：各種聚合物基吸附劑在商業(yè)面上,，涵蓋了廣泛的極性和化學(xué)性質(zhì)。最常見的聚合物吸附劑是基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,。通過胺化或磺化的進一步修飾有助于創(chuàng)建離子交換聚合物吸附劑,。一些極性官能團的摻入使吸附劑可潤濕,，這為保留機制提供了額外的可能性。聚合物基固定相的一個重要優(yōu)點是,，即使它們在SPE過程中干燥,，它們的化學(xué)性質(zhì)也不會改變，而且用于硅基SPE柱/墨盒/板的初始調(diào)節(jié)步驟可能不需要,。此外,，與硅基吸附劑相比，大多數(shù)聚合吸附劑在整個pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的,。

LC-MS生物分析中常用的SPE平臺

根據(jù)各自的保留機制,，LC-MS生物分析中常用的SPE可分為三類，即反相SPE,、離子交換SPE和混合模式SPE,。正相SPE設(shè)計用于從有機提取物、極非極性溶劑和油脂等中提取分析物,。由于它很少應(yīng)用于血漿和尿液等生物基質(zhì)的樣品提取,，因此不包括在目前的討論中。

●反相SPE：它采用了硅基或聚合物基吸附劑的非極性固定相,，它們保留了大多數(shù)具有任何疏水特性的分子,。硅基非極性吸附劑的常見官能團包括但不限于C18、C8,、C6,、C4、C2,、C1,、苯基、環(huán)己基和氰丙基,。在這些類群中,，短鏈鏈（如C1、C2）的保留性較低,，而長鏈（如C18）的保留性較強,。與其他類型的SPE相比，反相SPE被認為是最少的選擇性保留機制,。正因為如此,，它對于在同一樣本中提取結(jié)構(gòu)非常不同的分析物非常有用。

●離子交換SPE：它利用吸附劑的離子官能團（強或弱有機酸和堿）,，可以進一步分類為強/弱陽離子/陰離子離子交換SPE：

1. 強陽離子交換（SCX）SPE：吸附劑通常含有磺酸作為離子交換的離子基團,。磺酸的pKa值很低,，并且?guī)缀踉谡麄€pH范圍內(nèi)都帶負電荷,。

2. 弱陽離子交換（WCX）SPE：吸附劑中通常含有羧酸作為離子基團,。羧酸是弱酸，pKa值在4.5-5.0左右,，僅在部分pH范圍內(nèi)被電離,。如果SPE柱/盒/板中的pH調(diào)整到pH值3以上，離子交換器就會逐漸“打開”,。相反,，如果pH被降低到pH值3以下,，離子交換器就會“關(guān)閉”,。

3. 強陰離子交換（SAX）SPE：吸附劑通常含有季胺基團作為官能團。季胺在整個pH范圍內(nèi)都帶正電荷,。

4. 弱陰離子交換（WAX）SPE：吸附劑中通常含有仲胺或叔胺作為離子交換的官能團,。二胺或叔胺為弱堿基，pKa值為~值10,。因此,，通過調(diào)整pH值>為10，離子交換器逐漸“關(guān)閉”,。相反,，如果pH被調(diào)整到遠低于pH值為10，即pH值為8或更低,，離子交換器就會“打開”,。

   ●混合模式SPE：混合模式SPE是一種提取方法，涉及吸附劑表現(xiàn)出兩個或更多的主要相互作用,，以保留感興趣的分析物,。商業(yè)上可用的混合模式吸附劑可以是硅或聚合物基的，通常通過將吸附劑與兩個不同的官能團（如C2,、C8與硫酸鹽）同時結(jié)合,，或以適當(dāng)?shù)谋壤旌想x散吸附劑化學(xué)，以創(chuàng)建保留性能的組合,。常用的混合模式吸附劑具有疏水官能團與離子交換官能團結(jié)合,。疏水基團可以是短鏈（如C2)，也可以是長鏈（如C18)這是高度保留的,。離子交換器可以是陽離子取向或陰離子導(dǎo)向的,。混合模式SPE允許通過離子和疏水相互作用使化合物保留

一般SPE工作流

從技術(shù)上講,，SPE是一種低壓色譜法的形式,，可以通過LC-MS系統(tǒng)離線或在線進行。在開發(fā)基于SPE的LC-MS生物分析樣品制備方法時,，除了相關(guān)分析物的理化性質(zhì)外,，需要考慮的參數(shù)包括(i)吸附劑的類型和數(shù)量,，（ii）樣品體積（考慮初始分析、重復(fù)分析和發(fā)生的樣品再分析所需的體積）,，以及（iii）加載,、洗滌和洗脫條件（時間、體積和成分）,。

與LC柱類似,，各種SPE產(chǎn)品有各種形式的商業(yè)。這些包括但不限于一次性墨盒,，多孔板（96孔,，384孔），和來自一些主要供應(yīng)商的在線SPE柱,。一般來說,，每個特定的SPE產(chǎn)品都提供了供應(yīng)商推薦的程序或方法協(xié)議。這些程序或協(xié)議應(yīng)被視為對感興趣的分析物的預(yù)期SPE方法的方法開發(fā)的起點,。

反相SPE

反相SPE是從水溶液中提取相對非極性分析物的常用方法,。

●萃取機理：被分析物與固定相之間的疏水相互作用。通過范德華力,，隨著分析物的疏水性的增加而增加,，這主要是在固定相中的氫碳鍵和分析物分子中的氫碳鍵之間。這種相互作用在水相中被促進,，但在有機相中被抑制或破壞,。

●適用分析物：logP值為>1.0的化合物，可以考慮大多數(shù)商業(yè)化的硅基或聚合物基反相SPE,。然而,，對于logP值在?1.0到1.0之間的化合物，最好考慮改性聚合物基反相SPE,，因為聚合物基SPE吸附材料的極性改性比硅基C18或C8材料的極性選擇性增加,；對于logP值為<?0.1的化合物，它們在反相SPE上的保留率較差,，一般不推薦反相SPE,。

●樣品預(yù)處理：樣品需要用適當(dāng)?shù)木彌_液或水稀釋（對于中性化合物）。對于可電離化合物,，pH的調(diào)整是重要的,，因為感興趣的分析物(s)的電離狀態(tài)可以極大地改變其在給定的RP SPE吸附劑上的保留和洗脫特性。一般規(guī)則是將樣品pH調(diào)整到高于（堿性化合物）或低于（酸性化合物）pKa值的2個pH值,，以確?；衔镌谘b入SPE柱/盒/板之前被中和。除了常用的緩沖液，一些常見的試劑,，如2%甲酸,、2%羧酸、2%乙酸,、TFA,、磷酸或氫氧化銨、碳酸氫鈉,、碳酸鈉,，可用于樣品處理。

●活化：吸附劑調(diào)節(jié)是“激活”或“濕”SPE吸附劑,，以確保感興趣的分析物(s)與SPE吸附劑的官能團之間的一致相互作用,。最常見的調(diào)節(jié)方法是將一到兩體積的水混溶有機溶劑（通常是甲醇或乙腈）應(yīng)用于反相吸附劑。隨后,，通過引入一種在溶劑強度和pH方面類似于樣品裝載的溶液來平衡SPE吸附劑,，以最大限度地保留對SPE吸附劑感興趣的分析物,。一到兩體積的緩沖液（與樣品預(yù)處理相同）或水（對于中性化合物）是平衡反相吸附劑的常用選擇,。

●裝樣：裝樣的關(guān)鍵因素是樣品通過SPE吸附劑時的線速度，以確保最佳保留,。對于離線應(yīng)用,，樣品通常被允許通過自然重力流動，以確保樣品與感興趣的分析物(s)與固定相的接觸時間,。水樣可以直接加載到平衡的反相SPE柱/筒/板上,。被分析物的非極性性質(zhì)導(dǎo)致了與SPE吸附劑的固定相的疏水相互作用的強保留。

●洗滌：生物樣品基質(zhì)中的干擾化合物通常與感興趣的分析物共同保留在反相SPE柱/盒/板上,。洗滌的目標是選擇性地去除不需要的基質(zhì)成分,，同時將感興趣的分析物(s)保留在SPE吸附劑上。在洗滌步驟中,，通常首先使用純水或緩沖液來去除水溶性干擾（例如,，極性化合物或鹽），對SPE吸附劑沒有親和力,。隨后使用溶劑,，通常是比水或緩沖液洗脫強度更高的甲醇水溶液，盡可能清洗樣品,，但不清洗感興趣的分析物,。這將需要一定程度的評價和/或優(yōu)化，在此期間,，通過增加有機溶劑的百分比,，對洗滌液進行分析，以確定和/或確認洗滌溶劑的最佳強度。一般來說,，感興趣的分析物的logP值越高,，其與反相SPE吸附劑材料的相互作用越強，洗滌溶劑也越強,。一個很好的估計是,，感興趣的分析物的logP值每增加一個單位，將松散地對應(yīng)于洗滌溶液中甲醇（在水中）中10%的增加10%,。例如,，睪酮的logP值為3.37，在洗滌溶劑中使用35%的~甲醇可以在最小的背景干擾下獲得分析物的最佳回收率,。為了有效地優(yōu)化洗滌溶液,，其強度在估計百分比（例如35%甲醇）附近的溶劑可以是一個很好的起點，將其與±10%（即25,、35和45%）的甲醇包起來,。

●洗脫：洗脫是為了破壞具有有機溶劑（如甲醇或乙腈）或溶劑組合的反相SPE吸附劑的官能團之間的所有疏水相互作用。否則,，可能會發(fā)生部分洗脫,。部分洗脫通常與不可重復(fù)的LC-MS結(jié)果和感興趣的分析物的REC較差和不一致有關(guān)。一般來說,，較高的logP值化合物需要更強的溶劑或溶劑組合,，才能獲得最高的REC和zuidi的洗脫體積。因此,，在反相SPE中,，極性較低的溶劑是一種較強的洗脫溶劑。換句話說,，選擇一個更非極性的溶劑會得到更好的結(jié)果,。如果分析物(s)是堿性或酸性化合物，應(yīng)調(diào)整洗脫溶劑的pH值以給分析物(s)充電,，從而進一步減少疏水相互作用,。在這種情況下，使用較弱的洗脫溶劑和/或減少洗脫體積可能是可行的,。在實踐中,，洗脫過程中一致和低流量通常與提高回收率和重現(xiàn)性有關(guān)。洗脫步驟被認為是樣品清理的額外機會,。使用一個非常強的洗脫溶劑經(jīng)常導(dǎo)致干擾的洗脫與感興趣的分析物,。因此，洗脫步驟應(yīng)該使用盡可能弱的溶劑,，提供分析物(s)的wanquan洗脫,，但在最終洗脫液中沒有或最小的干擾化合物。在這方面，洗脫液的優(yōu)化應(yīng)通過逐步降低洗脫溶劑的強度,，從高（如100%甲醇）到低,，并監(jiān)測洗脫液中的回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

●直接LC-MS分析洗脫液或蒸發(fā),，然后重建產(chǎn)生的殘留物進行LC-MS分析：在反相SPE中,，如果反相洗脫液比起始流動相少，則所得洗脫液可以進行直接LC-MS分析,。然而,，在許多應(yīng)用中，在反相LC-MS分析之前,，需要蒸發(fā)有機溶劑并使用起始流動相復(fù)溶產(chǎn)生的殘留物,。