固相萃取（SPE）

SPE是一種功能強大的樣品制備技術,，幾十年來一直用于各種生物樣品中微量分析物的選擇性提取和富集,。SPE的作用機制與液相色譜法類似，它是基于溶解在液體（流動相）中的溶質（感興趣的分析物）和吸附劑材料（固定相）之間的親和性或相互作用,。由于物理化學性質的不同，液體樣品中的不同組分在SPE器件的固定相中與吸附劑有不同的親和性或相互作用。通過SPE,，液體樣品經過適當處理（稀釋、pH調整和/或添加IS)后,，裝載到填充適當吸附材料的預處理/平衡柱/筒/板上,；通過不同的吸附材料相互作用（固定相）相互作用被保留；干擾基質組件在加載過程中直接通過柱/筒/板,，或在清洗過程中用適當?shù)娜軇┣逑?；隨后用合適的洗脫溶劑從柱/筒/板中洗脫感興趣的分析物。收集到的洗脫液要么直接進行LC-質譜分析,，要么進行干燥過程以蒸發(fā)有機溶劑,。在LC-質譜分析之前，用適當?shù)娜軇┲亟M或開始流動相,。使用SPE,，可以預防或最小化與PPT和/或LLE相關的一些問題。這些問題包括但不限于(i)PPT中的基質效應和（ii）LLE中不wanquan相分離導致的恢復較差,。SPE產品可從各種供應商處提供各種化學物質,、吸附劑、尺寸和格式,，以適應不同的樣品尺寸和生物分析應用,。

SPE固定相（吸附劑）

SPE吸附劑材料通常是不規(guī)則形狀的剛性顆粒，標稱尺寸從8到70μm（最常見的是40-60μm）,，這允許在加載,、洗滌和洗脫過程中樣品或溶液通過吸附劑床的合理的流速。SPE吸附材料的較小顆粒需要更高的壓力。例外的是板格式的吸附劑材料,。由于這種格式的床路徑非常短,，由于粒徑小，所產生的總電阻小于格式化成柱或盒的典型吸附床,。大多數(shù)SPE材料在本質上是wanquan多孔的,。吸附劑材料的小孔隙率與較高的總表面積有關，因此,，吸附劑材料的活性吸附容量更高,。通常，SPE吸附劑中給定的吸附劑材料的容量約為每質量吸附劑的百分之一（%）保留化合物（例如,，5毫克化合物被100毫克吸附劑保留）,。SPE吸附劑可大致可分為兩大類，即硅基吸附劑和聚合物基吸附劑,。

硅基吸附劑：根據(jù)定義,，硅基吸附劑是通過將不同的官能團與硅結合而制成的，盡管堿基硅在一些SPE工作流程中也起著積極的作用,。許多商業(yè)上可用的硅基吸附劑都使用首字母縮寫來命名,。這些首字母縮寫描述了二氧化硅上各自官能團的主要特征，包括C18,、C8,、C6、C4,、C2,、苯基、環(huán)己基,、氰丙基,、氨基丙基、二乙胺,、二醇,、丙基磺酸、苯磺酸,、丙基羧酸和丙基三甲基胺,。基于c18的SPE柱/墨盒/板是非常受歡迎的和最疏水性的,。由于其很強的疏水性,，它們對許多化合物具有很強的保留性。然而,，它可能不能提供好的選擇性,。為了在SPE中獲得更好的選擇性，可以使用疏水相較少的SPE柱/墨盒/板，如c8柱,，這也非常流行,。

無論在制造硅基SPE吸附劑時使用哪種鍵化學，由于結合官能團的空間因素,，殘留在吸附劑表面的未反應（或殘留的）硅醇種類的數(shù)量仍然很高（典型的c18鍵相的>50%）,。這些硅醇物種能夠與分析物分子相互作用,，往往導致意外的保留效應和較低的提取效率,。在溶液的pH ~4中，硅表面約50%的硅醇被電離,。因此,，可以調整溶液pH，以確保硅烷醇物種的離子抑制（pH≤2）或wanquan電離（pH≥6）,。需要注意的是,，當暴露在jiduanpH中時，硅吸附劑可能會被水解,。在pH值為2時,，鍵合表面易于水解，吸附劑的效率可以大大降低,。在pH值為8時,，二氧化硅本身易于水解，吸附劑在長期暴露后迅速惡化,。

聚合物基吸附劑：各種聚合物基吸附劑在商業(yè)面上,，涵蓋了廣泛的極性和化學性質。最常見的聚合物吸附劑是基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,。通過胺化或磺化的進一步修飾有助于創(chuàng)建離子交換聚合物吸附劑,。一些極性官能團的摻入使吸附劑可潤濕，這為保留機制提供了額外的可能性,。聚合物基固定相的一個重要優(yōu)點是,，即使它們在SPE過程中干燥，它們的化學性質也不會改變,，而且用于硅基SPE柱/墨盒/板的初始調節(jié)步驟可能不需要,。此外，與硅基吸附劑相比,，大多數(shù)聚合吸附劑在整個pH范圍內是穩(wěn)定的,。

LC-MS生物分析中常用的SPE平臺

根據(jù)各自的保留機制，LC-MS生物分析中常用的SPE可分為三類,，即反相SPE,、離子交換SPE和混合模式SPE。正相SPE設計用于從有機提取物、極非極性溶劑和油脂等中提取分析物,。由于它很少應用于血漿和尿液等生物基質的樣品提取,，因此不包括在目前的討論中。

●反相SPE：它采用了硅基或聚合物基吸附劑的非極性固定相,，它們保留了大多數(shù)具有任何疏水特性的分子,。硅基非極性吸附劑的常見官能團包括但不限于C18、C8,、C6,、C4、C2,、C1,、苯基、環(huán)己基和氰丙基,。在這些類群中,，短鏈鏈（如C1、C2）的保留性較低,，而長鏈（如C18）的保留性較強,。與其他類型的SPE相比，反相SPE被認為是最少的選擇性保留機制,。正因為如此,，它對于在同一樣本中提取結構非常不同的分析物非常有用。

●離子交換SPE：它利用吸附劑的離子官能團（強或弱有機酸和堿）,，可以進一步分類為強/弱陽離子/陰離子離子交換SPE：

1. 強陽離子交換（SCX）SPE：吸附劑通常含有磺酸作為離子交換的離子基團,。磺酸的pKa值很低,，并且?guī)缀踉谡麄€pH范圍內都帶負電荷,。

2. 弱陽離子交換（WCX）SPE：吸附劑中通常含有羧酸作為離子基團。羧酸是弱酸,，pKa值在4.5-5.0左右,，僅在部分pH范圍內被電離。如果SPE柱/盒/板中的pH調整到pH值3以上,，離子交換器就會逐漸“打開”,。相反，如果pH被降低到pH值3以下,，離子交換器就會“關閉”,。

3. 強陰離子交換（SAX）SPE：吸附劑通常含有季胺基團作為官能團。季胺在整個pH范圍內都帶正電荷,。

4. 弱陰離子交換（WAX）SPE：吸附劑中通常含有仲胺或叔胺作為離子交換的官能團,。二胺或叔胺為弱堿基,，pKa值為~值10。因此,，通過調整pH值>為10,，離子交換器逐漸“關閉”。相反,，如果pH被調整到遠低于pH值為10,，即pH值為8或更低，離子交換器就會“打開”,。

   ●混合模式SPE：混合模式SPE是一種提取方法,，涉及吸附劑表現(xiàn)出兩個或更多的主要相互作用，以保留感興趣的分析物,。商業(yè)上可用的混合模式吸附劑可以是硅或聚合物基的,，通常通過將吸附劑與兩個不同的官能團（如C2,、C8與硫酸鹽）同時結合,，或以適當?shù)谋壤旌想x散吸附劑化學，以創(chuàng)建保留性能的組合,。常用的混合模式吸附劑具有疏水官能團與離子交換官能團結合,。疏水基團可以是短鏈（如C2)，也可以是長鏈（如C18)這是高度保留的,。離子交換器可以是陽離子取向或陰離子導向的,。混合模式SPE允許通過離子和疏水相互作用使化合物保留

一般SPE工作流

從技術上講,，SPE是一種低壓色譜法的形式,，可以通過LC-MS系統(tǒng)離線或在線進行。在開發(fā)基于SPE的LC-MS生物分析樣品制備方法時,，除了相關分析物的理化性質外,，需要考慮的參數(shù)包括(i)吸附劑的類型和數(shù)量，（ii）樣品體積（考慮初始分析,、重復分析和發(fā)生的樣品再分析所需的體積）,，以及（iii）加載、洗滌和洗脫條件（時間,、體積和成分）,。

與LC柱類似，各種SPE產品有各種形式的商業(yè),。這些包括但不限于一次性墨盒,，多孔板（96孔，384孔）,，和來自一些主要供應商的在線SPE柱,。一般來說,，每個特定的SPE產品都提供了供應商推薦的程序或方法協(xié)議。這些程序或協(xié)議應被視為對感興趣的分析物的預期SPE方法的方法開發(fā)的起點,。

反相SPE

反相SPE是從水溶液中提取相對非極性分析物的常用方法,。

●萃取機理：被分析物與固定相之間的疏水相互作用。通過范德華力,，隨著分析物的疏水性的增加而增加,，這主要是在固定相中的氫碳鍵和分析物分子中的氫碳鍵之間。這種相互作用在水相中被促進,，但在有機相中被抑制或破壞,。

●適用分析物：logP值為>1.0的化合物，可以考慮大多數(shù)商業(yè)化的硅基或聚合物基反相SPE,。然而,，對于logP值在?1.0到1.0之間的化合物，最好考慮改性聚合物基反相SPE,，因為聚合物基SPE吸附材料的極性改性比硅基C18或C8材料的極性選擇性增加,；對于logP值為<?0.1的化合物，它們在反相SPE上的保留率較差,，一般不推薦反相SPE,。

●樣品預處理：樣品需要用適當?shù)木彌_液或水稀釋（對于中性化合物）。對于可電離化合物,，pH的調整是重要的,，因為感興趣的分析物(s)的電離狀態(tài)可以極大地改變其在給定的RP SPE吸附劑上的保留和洗脫特性。一般規(guī)則是將樣品pH調整到高于（堿性化合物）或低于（酸性化合物）pKa值的2個pH值,，以確?；衔镌谘b入SPE柱/盒/板之前被中和。除了常用的緩沖液,，一些常見的試劑,，如2%甲酸、2%羧酸,、2%乙酸,、TFA、磷酸或氫氧化銨,、碳酸氫鈉,、碳酸鈉，可用于樣品處理,。

●活化：吸附劑調節(jié)是“激活”或“濕”SPE吸附劑,，以確保感興趣的分析物(s)與SPE吸附劑的官能團之間的一致相互作用。最常見的調節(jié)方法是將一到兩體積的水混溶有機溶劑（通常是甲醇或乙腈）應用于反相吸附劑,。隨后,，通過引入一種在溶劑強度和pH方面類似于樣品裝載的溶液來平衡SPE吸附劑,，以最大限度地保留對SPE吸附劑感興趣的分析物。一到兩體積的緩沖液（與樣品預處理相同）或水（對于中性化合物）是平衡反相吸附劑的常用選擇,。

●裝樣：裝樣的關鍵因素是樣品通過SPE吸附劑時的線速度,，以確保最佳保留。對于離線應用,，樣品通常被允許通過自然重力流動,，以確保樣品與感興趣的分析物(s)與固定相的接觸時間。水樣可以直接加載到平衡的反相SPE柱/筒/板上,。被分析物的非極性性質導致了與SPE吸附劑的固定相的疏水相互作用的強保留,。

●洗滌：生物樣品基質中的干擾化合物通常與感興趣的分析物共同保留在反相SPE柱/盒/板上。洗滌的目標是選擇性地去除不需要的基質成分,，同時將感興趣的分析物(s)保留在SPE吸附劑上,。在洗滌步驟中，通常首先使用純水或緩沖液來去除水溶性干擾（例如,，極性化合物或鹽）,，對SPE吸附劑沒有親和力。隨后使用溶劑,，通常是比水或緩沖液洗脫強度更高的甲醇水溶液,，盡可能清洗樣品，但不清洗感興趣的分析物,。這將需要一定程度的評價和/或優(yōu)化，在此期間,，通過增加有機溶劑的百分比,，對洗滌液進行分析，以確定和/或確認洗滌溶劑的最佳強度,。一般來說,，感興趣的分析物的logP值越高，其與反相SPE吸附劑材料的相互作用越強,，洗滌溶劑也越強,。一個很好的估計是，感興趣的分析物的logP值每增加一個單位,，將松散地對應于洗滌溶液中甲醇（在水中）中10%的增加10%,。例如，睪酮的logP值為3.37,，在洗滌溶劑中使用35%的~甲醇可以在最小的背景干擾下獲得分析物的最佳回收率,。為了有效地優(yōu)化洗滌溶液，其強度在估計百分比（例如35%甲醇）附近的溶劑可以是一個很好的起點,，將其與±10%（即25,、35和45%）的甲醇包起來,。

●洗脫：洗脫是為了破壞具有有機溶劑（如甲醇或乙腈）或溶劑組合的反相SPE吸附劑的官能團之間的所有疏水相互作用。否則,，可能會發(fā)生部分洗脫,。部分洗脫通常與不可重復的LC-MS結果和感興趣的分析物的REC較差和不一致有關。一般來說,，較高的logP值化合物需要更強的溶劑或溶劑組合,，才能獲得最高的REC和zuidi的洗脫體積。因此,，在反相SPE中,，極性較低的溶劑是一種較強的洗脫溶劑。換句話說,，選擇一個更非極性的溶劑會得到更好的結果,。如果分析物(s)是堿性或酸性化合物，應調整洗脫溶劑的pH值以給分析物(s)充電,，從而進一步減少疏水相互作用,。在這種情況下，使用較弱的洗脫溶劑和/或減少洗脫體積可能是可行的,。在實踐中,，洗脫過程中一致和低流量通常與提高回收率和重現(xiàn)性有關。洗脫步驟被認為是樣品清理的額外機會,。使用一個非常強的洗脫溶劑經常導致干擾的洗脫與感興趣的分析物,。因此，洗脫步驟應該使用盡可能弱的溶劑,，提供分析物(s)的wanquan洗脫,，但在最終洗脫液中沒有或最小的干擾化合物。在這方面,，洗脫液的優(yōu)化應通過逐步降低洗脫溶劑的強度,，從高（如100%甲醇）到低，并監(jiān)測洗脫液中的回收率和基質效應,。

●直接LC-MS分析洗脫液或蒸發(fā),，然后重建產生的殘留物進行LC-MS分析：在反相SPE中，如果反相洗脫液比起始流動相少,，則所得洗脫液可以進行直接LC-MS分析,。然而，在許多應用中,，在反相LC-MS分析之前,，需要蒸發(fā)有機溶劑并使用起始流動相復溶產生的殘留物。