本文轉(zhuǎn)載自浙大實驗設(shè)備處公眾號

編者說

大型科研儀器是科研實現(xiàn)原創(chuàng)性突破的利器,，開放共享開辟了科技創(chuàng)新的新賽道,。為促使我校大型儀器共享與服務(wù)水平上一個新的臺階，讓“器”的投入最終在“智”上顯出更廣更大的效應(yīng)和價值,，實驗室與設(shè)備管理處微信公眾號將陸續(xù)推出“大儀說”系列報道,，旨在幫助校內(nèi)外用戶深入了解學(xué)校大型科研儀器設(shè)備，促進共享與合作,。

大儀速寫

傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡以單譜線激光器作為光源,，利用不同熒光探針標(biāo)記生物樣本內(nèi)不同組分，分析熒光強度參數(shù)實現(xiàn)較高的成像對比度和特異性,，但檢測結(jié)果易受熒光團濃度,、激發(fā)光強度、光漂白等因素影響,。熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）不受激發(fā)光強度,、熒光團濃度、光漂白等因素影響,。熒光壽命與熒光團所處的微環(huán)境密切相關(guān),，能反映微環(huán)境中pH、折射率,、離子濃度等變化,，是熒光團的固有屬性。通過測量熒光壽命可精準(zhǔn)定量不同樣本或?qū)崟r分析處于不同狀態(tài)的生物樣品,，獲得與熒光光譜技術(shù),、熒光強度檢測技術(shù)互補的結(jié)構(gòu)與功能信息。熒光壽命測量系統(tǒng)基于激光掃描共聚焦顯微系統(tǒng)（LSCM）的搭建,，熒光壽命成像變得高效且簡單,。

圖3. 全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)（Stellaris 8 Falcon）

該設(shè)備的工作原理是什么,？

該設(shè)備基于倒置激光共聚焦顯微鏡,，集成了全光譜連續(xù)可調(diào)脈沖激光器激發(fā)系統(tǒng)，搭載精準(zhǔn)光子計數(shù)模式高靈敏混合探測器（HyD）,，不僅可實現(xiàn)強度成像,，也讓熒光壽命成像變得高效且簡單。

熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的平均時間ns,。通過觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測量熒光染料的典型壽命,。測量圖像中所有像素平均光子到達時間，即熒光壽命成像(FLIM）,。熒光壽命范圍一般在0.2-20ns之間,，反映了熒光分子內(nèi)在屬性和所處微環(huán)境。

圖4. 熒光壽命成像原理

在功能上有什么du特性和先進性,？

1）熒光強度測量,。配備自由連續(xù)可調(diào)脈沖白激光器，擁有351根激發(fā)譜線,，可同時分離8根激光譜線,；加上超高靈敏度熒光檢測范圍達850 nm的檢測器。自由選擇染料并同時8色成像,，輕松實現(xiàn)一些特殊染料或近紅外染料的快速成像,。

2）熒光壽命測量。實現(xiàn)視頻速率的快速熒光壽命成像,，可用于監(jiān)測代謝狀態(tài)和微環(huán)境變化,、分子間快速相互作用(FLIM-FRET)、膜張力研究（Flipper-TR）,、不同壽命組分高效拆分等,。

熒光壽命檢測模塊和共聚焦的整合,，既能做最基礎(chǔ)的單光子共聚焦成像，又能實現(xiàn)高分辨的高精度特殊多色成像,?？稍趤喖毎缴蠙z測Ca²⁺、pH值,、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化,。同時具備FLIM熒光壽命成像功能支持多種應(yīng)用。

該設(shè)備為科學(xué)研究帶來哪些新應(yīng)用,？

該設(shè)備是目前功能極為全面的全光譜激光共聚焦成像系統(tǒng),。具備FLIM熒光壽命成像模塊、Lightning高分辨成像模塊,、共聚焦常規(guī)模塊（3D,、時間、多點,、光譜掃描,、大視野拼圖）和活細胞孵育系統(tǒng)，除了完成細胞或組織內(nèi)熒光信號的檢測外,，還可開展FLIM熒光壽命成像,，F(xiàn)LIM-FRET、組分分析分離,、局部離子濃度,、微環(huán)境(如pH值)、區(qū)分光譜近似的染料,、區(qū)分染料和自發(fā)熒光等多種普通共聚焦無法實現(xiàn)的gao端實驗,。

在傳統(tǒng)熒光強度和熒光光譜兩個維度的基礎(chǔ)上，又增加了熒光壽命這一新的成像維度,，大大拓展了該系統(tǒng)在細胞生物學(xué),、生物化學(xué)、生理學(xué),、神經(jīng)生物學(xué)等眾多學(xué)科中的應(yīng)用,。

目前有哪些應(yīng)用案例?

在功能成像領(lǐng)域中，監(jiān)測小分子,、離子或電勢的動態(tài)變化,，通常是用熒光探針來完成，其中多數(shù)顯示出強度和壽命的變化,。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質(zhì),，并在活細胞中表達這些構(gòu)建體。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質(zhì)或肽，它們與所需的分析物（如Ca²⁺）結(jié)合,，并裝飾有一對進行FRET的熒光蛋白,。結(jié)合分析物后，肽發(fā)生構(gòu)象變化,，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失,。這些探針被稱為FRET-生物傳感器,。生物傳感器的一種是利用cAMP結(jié)合蛋白Epac,。

這臺設(shè)備開放共享情況如何？可以通過什么途徑聯(lián)系使用它？

全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)自2023年6月引進正式投入使用以來,，已服務(wù)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,、藥學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院,、農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,、化學(xué)工程與生物工程學(xué)院、附屬醫(yī)院等校內(nèi)外多家單位,，累計機時近兩千小時,，培訓(xùn)師生近百人。未來,，我們希望繼續(xù)提高設(shè)備利用率,，加強開放共享，更好的服務(wù)廣大科研用戶,，期待與更多單位開展合作研究,。

如果需要使用這臺儀器，可登入浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺網(wǎng)站或聯(lián)系楊老師進行預(yù)約,。

內(nèi)容來源：醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺

今日編輯：張雨樓