前言

乳鐵蛋白，這一名字中的“蛋白”源自拉丁文“proteios”,，寓意著它在自然界中的至關(guān)重要的地位。它是天然存在于哺乳動(dòng)物乳汁中的一種特殊蛋白質(zhì),。在人體內(nèi),，蛋白質(zhì)是構(gòu)建身體組織、調(diào)節(jié)生理功能的重要物質(zhì),，而乳鐵蛋白更是其中的佼佼者,，作為一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白,，它的重要性不言而喻。

近年來,，乳鐵蛋白應(yīng)用越來越廣泛,，不僅是牛奶中的營(yíng)養(yǎng)寶藏，還因?yàn)槠鋸?qiáng)大的抗菌,、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用,，在保健品、嬰幼兒配方奶粉及護(hù)膚品領(lǐng)域中嶄露頭角,。然而,，乳鐵蛋白對(duì)外部環(huán)境，尤其是溫度的變化非常敏感,。一旦溫度過高,，就極易破壞其穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其功能的正常發(fā)揮,。

為了解決這一技術(shù)難題,，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 4439-2023（2024.5.1實(shí)施），該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)介紹了一種高效液相色譜法用于奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定,。這一方法的實(shí)施,，將有助于我們更準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶中未變性的乳鐵蛋白含量，從而為奶業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展提供有力支持,。

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實(shí)驗(yàn)部分

色譜條件

賽里安LC6000超高效液相色譜

表1. 方法參數(shù)

試劑及標(biāo)準(zhǔn)品配置

乙腈（HPLC級(jí)）,；三氟乙酸（HPLC級(jí)）；

牛乳鐵蛋白（編號(hào)：CDAA-200251）

①磷酸鹽緩沖液Ⅰ：稱取7.1 g磷酸氫二鈉,、58.4 g氯化鈉,，加900 mL水溶解，用磷酸調(diào)pH至8.0±0.2,，加水定容至1000 mL,，臨用現(xiàn)配。

②磷酸鹽緩沖液Ⅱ：稱取28.4 g磷酸氫二鈉,，加800 mL水溶解,，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5±0.2，再加入20 mL乳鐵蛋白結(jié)合液A,，加水稀釋至1000 mL,。

Tip：使用磷酸鹽緩沖液來配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液和稀釋待測(cè)樣品，提取其中乳鐵蛋白,。這一步的原理是乳鐵蛋白在適當(dāng)?shù)膒H值和離子強(qiáng)度條件下具有良好的溶解性,。而磷酸氫二鈉可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值和離子強(qiáng)度，有助于乳鐵蛋白從食品基質(zhì)（如牛乳,、乳粉等）中溶解出來,。在提取過程中,，磷酸氫二鈉提供的緩沖環(huán)境能夠保護(hù)乳鐵蛋白不受酸堿變化的影響，從而保持其穩(wěn)定性和生物活性,。提取后的離心操作,，將溶解了乳鐵蛋白的緩沖液與食品基質(zhì)中的不溶物分離，以便后續(xù)純化和檢測(cè),。

結(jié)果

示例圖譜

乳鐵蛋白分離度好,，出峰尖銳，詳見圖1,。

圖1 乳鐵蛋白50mg/L示例色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線

將乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為0、2.0,、5.0,、10.0、20.0,、50.0,、100.0mg/L使用外標(biāo)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定量 ，以濃度為橫坐標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)作外標(biāo)工作曲線 ,；乳鐵蛋白響應(yīng)值和濃度呈良好的線性關(guān)系,，所得到的相關(guān)系數(shù)在0 .9990以上，詳見圖2,。

圖2 乳鐵蛋白0-100mg/L重疊圖

重現(xiàn)性

乳鐵蛋白峰面積RSD%=1.66（n=6）保留時(shí)間RSD%=0.03（n=6）結(jié)果見表3,。

圖3 乳鐵蛋白50mg/L重疊圖（n=6）

結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用賽里安LC6000 UHPLC系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)乳鐵蛋白的檢測(cè),，靈敏度,、穩(wěn)定性、線性均滿足需求,。

實(shí)驗(yàn)總結(jié)

①乳鐵蛋白結(jié)合液A放置時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀,，使用前搖勻即可。

②配制磷酸鹽緩沖液Ⅱ時(shí),，調(diào)pH前的溶液pH值應(yīng)在9.00以上,，否則提取效率會(huì)降低。調(diào)完pH后加乳鐵蛋白結(jié)合液A然后定容,，定容后混勻即可,，不需要?jiǎng)×覕嚢瑁?/span>

③首次使用ChromCore 300 C4-T色譜柱時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)色譜峰型不對(duì)稱或響應(yīng)低的情況,，此時(shí)需要使用高濃度牛乳鐵蛋白對(duì)照品（400 μg/mL進(jìn)樣100 μL）對(duì)色譜柱進(jìn)行鈍化處理,，鈍化后將色譜柱沖洗至無(wú)牛乳鐵蛋白的目標(biāo)峰后，再進(jìn)行樣品分析,；

④因?yàn)榈鞍自贑4分析柱上會(huì)有一定殘留,，建議在做柱容量測(cè)試后,，空針進(jìn)樣兩次把蛋白殘留降低后再進(jìn)行后續(xù)測(cè)試

⑤色譜柱使用結(jié)束后，需用純乙腈沖洗30 min對(duì)色譜柱進(jìn)行保存,，保證下次色譜柱可以正常使用,。

寫在最后

檢測(cè)乳鐵蛋白含量的實(shí)驗(yàn)并不復(fù)雜，但是也是食品安全防線中的一部分,。除了乳鐵蛋白的檢測(cè),，賽里安還有多種產(chǎn)品和方案用于食品科學(xué)研究，這些產(chǎn)品方案在默默守護(hù)健康安全的餐桌的同時(shí),，也不斷助力食品科學(xué)的發(fā)展,。

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[5] 食品中乳鐵蛋白的提取與檢測(cè)（第二代肝素親和柱+乳鐵蛋白結(jié)合液）

[6] 新標(biāo)準(zhǔn)今日實(shí)施,！賽里安帶你全面解讀維生素D測(cè)定新方法！

[7] 熱點(diǎn)應(yīng)用丨賽里安LC6000-高效液相色譜法檢測(cè)原料乳及乳制品中的三聚氰胺 GB/T 22388-2008

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