非標記抗體免疫電鏡技術(shù)

一,、原理www.runwelltac.com

標記抗體法雖然具有許多優(yōu)點,，但也存在一些難以克服的問題,，如標記抗體的分子增大，對細胞膜和組織的穿透力減弱,；化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)對抗體和酶的活性有所影響,；結(jié)合物中未標記的抗體可與抗原競爭結(jié)合,，影響檢測方法的敏感性等。不標記抗體法可以避免上述的不利影響因素,，通過一系統(tǒng)的非標記抗體的免疫學(xué)反應(yīng),，對組織中的抗原進行定位檢測。不標記抗體法又可分為用標記物顯示和不同標記物顯示兩種方法,。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F（ab′）2,，一個Fab片段與標本中的抗原結(jié)合，一個Fab是抗體蛋白的結(jié)合片段,。在抗體與標本作用后,，再加入鐵蛋白與抗體結(jié)合，從而顯示組織內(nèi)抗原的所在部位,。后者則用磷酸鎢負染后,，直接電鏡觀察。

二,、材料及試劑

1．待檢病毒材料 如糞便,，氣管分泌物、腦脊髓液,、組織培養(yǎng)液等,。

2．高速離心機

3．已知抗體

4．磷鎢酸

5．瓊脂糖

6．其它

三、操作方法

1．經(jīng)典法

① 將被檢病毒材料0.9ml,，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合,。

② 置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃過夜。

③ 以17 000r/min～23 000r/min離心90min,。

④ 吸去上清,，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體,。

⑤ 沉淀物中加少量H₂O混懸，用3%磷鎢酸（pH6.0）負染20Sec～30Sec,，滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上,，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負染液。

⑥ 在透射電鏡下4×10⁴倍觀察,。

2．快速法（瓊脂擴散法）

① 制備免疫復(fù)合物,。

② 以生理鹽水或pH 7.2*緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上,，每片3ml,，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數(shù)粒,，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml,，冷卻凝固后,，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔,。

③ 將普通濾紙剪成2×3cm大小,，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上,。

④ 在凹孔內(nèi),，加入制備好的含病毒的免疫復(fù)合物懸液。

⑤ 將電鏡載網(wǎng)的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上,。由于瓊脂糖的吸水作用,，20min～30min后，可將液滴的水分吸干,，而濃縮的免疫復(fù)合物則粘附在載網(wǎng)膜上,。

⑥ 在載網(wǎng)膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec，過量的負染液用濾紙在載網(wǎng)邊緣輕輕吸去,。

⑦ 于透射電鏡4×10⁴倍下觀察,。

四、結(jié)果判定

直接觀察病毒粒子的形態(tài),。由于離心濃縮的處理和特異性抗體的加入,，大大提高了觀察的敏感性。