分子克隆常用技術(shù)  

一,、核酸的純化

　　在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的純化。其關(guān)鍵步驟是去蛋白質(zhì),，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可,。每當(dāng)需要把克隆有某一些所用的酶滅活或去除以便進(jìn)行下一步時,，可進(jìn)行這種抽提。然而,，如要從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸,，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機溶劑抽提,。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等,，它們對多種天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：這兩種有機溶劑合用,，比單獨用酚抽提的除蛋白效果更佳,。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸樣品置有蓋小離心管中,，加入等體積的酚/氯仿,。②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀,。③12000×g室溫離心15秒,。④水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相,。⑤重復(fù)步驟①－④步操作,，直至兩相界面上見不到蛋白質(zhì)為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。

二,、核酸的濃縮

　　應(yīng)用廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法,。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后,，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收,，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收,?；厥盏暮怂峥砂此铦舛?，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。
　　具體操作時,，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇,，混勻，放冰水浴中15－30min,，取出目測平衡,，0－4度，12000g,，離心10min,。吸棄上清，再另70%乙醇0.5－1ml,，12000g,，0－4度洗滌離心2min。吸棄上清,，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后,，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。

單價陽離子鹽溶液

*：當(dāng)加醋酸銨時,，需加入DNA液的V/2,。

單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀,，但在以后要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨,，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強烈抑制劑,。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時,，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高,，不隨核酸共沉淀,。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl,，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶,。DNA和RNA沉淀,，大多使用醋酸鈉（pH5.2）,。

三、DNA,、RNA的定量

　　準(zhǔn)確的方法是紫外分光光度法,。但本法要求核酸樣品是純凈的（即無顯著的蛋白質(zhì)、酚,、瓊脂糖或其它核酸,、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度計測定260nm和280nm兩個波長處的光吸收，然后,，按IA260相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA,。40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計算你的樣品含量,。260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值（A260/A280）,，可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染,，則A260/A280將明顯低于此值,，此時就無法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量?？蓪悠芳兓笤僮鞫繙y定,。有豐富實驗室經(jīng)驗的人，僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強度,，即可大致判斷出樣品中的核酸含量,，故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四,、核酸的凝膠電泳和分子量參照物

（一）瓊脂糖凝膠電泳
　　可用于分離,、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡單,、迅速,，能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物，分開的DNA可用低濃度的螢光染料（0.5μg/ml溴化乙錠）染色,，在紫外燈下直接觀察檢測少至1ng的DNA,。
DNA通過瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數(shù)：①DNA分子的大小：線獎雙鏈DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比,。據(jù)此用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測分子量的DNA片段同時電泳,，比較其電泳速率，即可求出待測片段的分子大小,。②瓊脂糖濃度：給定大小的DNA片段,，以不同速度通過不同濃度的瓊脂擴凝膠。因此利用不同濃度的凝膠,，可分辨范圍廣泛,，大小不同的DNA片段

不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍

③DNA構(gòu)型：相同分子量的閉環(huán)（Ⅰ型），開環(huán)（Ⅱ型）和線狀（Ⅲ型）DNA,，以不同速率通過凝膠,，一般情況下，遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型,。④應(yīng)用的電壓：在低電壓時,，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比,。但是壓增高時，大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的,，因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小,。為了獲得DNA片段的最大分辨力，凝膠電泳時電壓不應(yīng)超過5V/cm,。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳
　　可用于分析和制備小于1Kb長度的DNA片段

DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍

聚丙烯胺凝膠多用垂直平板電泳,，準(zhǔn)備凝膠時，先配制30%單體母液（29克丙烯酰胺,，1克雙丙烯酰胺,，加水溶解，定容至100ml）,，再用它來配制所需濃度的凝膠,。每100ml上述液體加30μl四甲基乙胺（TEMED），混勻后即可灌注于予先準(zhǔn)備好的潔凈不滲漏的凝膠玻板,，待凝膠灌至近頂端時,，立即插入合適的“梳子”，放室溫聚合60分鐘,，若冬天室溫太低,，則可放37度溫溫箱內(nèi)，以促進(jìn)聚合,。聚合完成后,，拔出“梳子”，將凝膠板固定于電泳槽中,，向電泳槽傾入1×TBE,，用滴管沖洗加樣孔和凝膠底部以除去氣泡，即可加樣電泳,。一般所用電壓1-8v/cm,，隨時觀察標(biāo)記染米的遷移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中,，標(biāo)記染料遷移速率與下述DNA片段的速率相同

標(biāo)記染料在PAG中的遷移*

*這些數(shù)字是與染料共同遷移的DNA片段的近似大?。ㄒ?/span>bp計）。電泳結(jié)束,，從電槽中取出玻板并小心地撬開,，凝膠浸于溴化乙錠液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外燈下觀察電泳結(jié)果,。

（三）分子量參照物
　　為了判斷目的DNA片段的大小,，常在同一凝膠的目的DNA旁加一分子量參照物,，同時電泳并染色后,，就能在紫外燈下很快知道目的片段的大小,。最*用的分子量參照物是 Hind Ⅲ消化物，各片段的大小以bp表示,，分別為：23130,，9416，6557,，4361,，2322，2027,，564,，125。