大鼠肺組織提取物培養(yǎng)步驟:

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),，85%,；北美胎牛血清(United States,，GIBCO，貨號16000-044),，15%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%,；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3）凍存液：90%*培養(yǎng)基，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。液氮儲存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。貼壁細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,，細(xì)胞變圓脫落后,，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。

大鼠肺位于胸腔內(nèi),，主要包含內(nèi)皮,，上皮，成纖維三種細(xì)胞,。公司科技提供來自新鮮或冷凍大鼠肺組織中高質(zhì)量的總RNA,，PCR準(zhǔn)備的條cDNA鏈，蛋白質(zhì)及其亞組分,。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量,。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆，表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究,。

總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA,，然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度,、總含量,、電泳照片、OD值測定結(jié)果等,。

cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA鏈,，以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA,。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng),。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng),。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴(yán)格的QA/QC分析,，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。

蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠肺 組織裂解液,，離心去除組織碎片,，通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF,，-80度保存,。