蛋白濃度測定的方法有很多,，但每種方法都有其特點和局限性,，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求,。例如凱氏定氮法結(jié)果精確，但操作復(fù)雜,，用于大批量樣品的測試則不太合適,；Lowry法精確度較高,，但是比較費時,，且每步的時間要求相對嚴格；Bradford法靈敏簡便,，但易受去垢劑的影響,；BCA法以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力強,，結(jié)果穩(wěn)定,，靈敏度高而受歡迎。在蛋白濃度測定中,，常見以下面四種方法為：

1. Bradford法：

原理：在酸性環(huán)境中,，蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍G250染料，導(dǎo)致染料的吸收發(fā)生位移,，從紅棕色形式（吸收峰 465nm）轉(zhuǎn)化為藍色形式（吸收峰 610nm）,。這兩種形式在 595nm 處光吸收差異most大,，因此 595nm 是測定考馬斯染料-蛋白復(fù)合物的藍色的best佳波長。結(jié)合到每個蛋白質(zhì)分子上的考馬斯染料分子數(shù)大致與蛋白所帶正電荷的數(shù)量成正比,，因此通過比色法可以測定溶液中蛋白質(zhì)的含量,。

優(yōu)點：

1. 靈敏度高，可以檢測到1μg/ml的蛋白質(zhì)濃度,。

2. 反應(yīng)時間短,，反應(yīng)時間只需5-10分鐘。

3. 操作簡單,，只需加入試劑,，混合均勻即可。

4. 適用范圍廣,，適用于大部分類型的蛋白質(zhì),。

5. 不受溶液中還原劑的影響。

缺點：

1. 受干擾：某些離子和化合物會干擾測定結(jié)果,，去垢劑（表面活性劑）會產(chǎn)生強烈干擾,，使得與許多常用的緩沖液不兼容。

2. 靈敏度不穩(wěn)定：不同蛋白質(zhì)的靈敏度不同,，有些蛋白質(zhì)可能無法被檢測到,。肽或蛋白質(zhì)的分子量必須大于 3,000 道爾頓才能被檢出。

3. 需要標(biāo)準(zhǔn)曲線：需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算蛋白質(zhì)濃度,，增加了操作步驟,。

近來市場上已出現(xiàn)能兼容去垢劑的Bradford法蛋白定量試劑盒，可以兼容各種常用的蛋白緩沖液,，大大拓展了應(yīng)用范圍,。

2. BCA法：

原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子,，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡(luò)合物,，這種絡(luò)合物溶于水并在562nm處產(chǎn)生光吸收峰值，光吸收強度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈近似線性關(guān)系,，因此使用比色法可以對蛋白質(zhì)進行檢測和定量,。BCA法沒有反應(yīng)終點，反應(yīng)會隨著時間而持續(xù)進行,；通過一段時間的孵育后,，反應(yīng)速度會變慢，從而可以對大量樣品進行檢測,。
優(yōu)點：

1. 靈敏度高,，可以檢測到低至0.5μg/mL的蛋白質(zhì)。

2. 對蛋白質(zhì)分子量沒有要求,，小分子量肽也可檢測,。

3. 結(jié)果穩(wěn)定可靠,，重復(fù)性好。

4. 可用于高通量的蛋白質(zhì)測定,。

5. 與Bradford法相比,，可耐受一定濃度的去垢劑。

缺點：

1. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM,，DTT和巰基乙醇均低于1mM,。

2. 對不同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性不同，因此不同蛋白質(zhì)靈敏度有差異,。

3. 與Bradford法相比,，操作相對較復(fù)雜，需要多個步驟,。

3. Lowry法：

原理：在堿性條件下,，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）,。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比,。通過比色法測定溶液中蛋白質(zhì)的含量,。

適合于測定20mg/L-400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液，可檢測的蛋白質(zhì)量低達5mg,，通常測定范圍是20~250mg,。

優(yōu)點：靈敏度高，可檢測低至1μg/mL的蛋白質(zhì),；對于大部分蛋白質(zhì)都有較好的線性關(guān)系,。

缺點：

1.操作相對較復(fù)雜，需要多個步驟,；

2.干擾物比較多,，不僅還原劑和去垢劑會產(chǎn)生干擾，酚類,、檸檬酸,、硫酸銨、tris緩沖液,、甘氨酸、糖類,、甘油等均有干擾作用,。

4. UV吸收法：

原理：利用蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）在280nm處的吸收峰,，測定溶液中蛋白質(zhì)的含量,。

優(yōu)點：操作簡單,，無需添加試劑；可同時測定多個樣品,。

缺點：靈敏度較低,，只能檢測高濃度的蛋白質(zhì)；對于某些蛋白質(zhì)（如酶）會產(chǎn)生干擾,，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確,。

5. 瓊脂糖凝膠電泳：

原理：通過比較待測樣品與已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的相對強度，估算待測樣品中蛋白質(zhì)的含量,。

優(yōu)點：

1. 瓊脂糖凝膠電泳測蛋白濃度簡單易行,，不需要昂貴的儀器設(shè)備。

2. 可以同時測定多個樣品的蛋白質(zhì)濃度,。

3. 可以測定不同分子量的蛋白質(zhì)濃度,。

缺點：

1. 瓊脂糖凝膠電泳測蛋白濃度的準(zhǔn)確性不如其他方法，誤差較大,。

2. 測定時間較長,，需要等待凝膠電泳完成。

3. 不能測定低濃度的蛋白質(zhì),，因為測定靈敏度較低,。