CHO細(xì)胞包括從CHO-ori細(xì)胞系衍生出CHO-DXB11 (DHFR+/-) ,、CHO-DG44 (-/-) 、CHO-GS,、CHO-K1SV等多種細(xì)胞系,，各具特定的特征，可分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染物并獲得高產(chǎn)量,。與其他重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞系相比,，CHO細(xì)胞具有更高的生產(chǎn)力，流加批次培養(yǎng)可達(dá)到1-10 g/L,。而相較于293細(xì)胞，病毒不易感染CHO細(xì)胞并在其中復(fù)制,。CHO細(xì)胞對(duì)于蛋白的翻譯后加工修飾與人類細(xì)胞的高度相似,，如糖基化、二硫鍵形成以及蛋白的水解加工,，但是也與人類細(xì)胞在翻譯后修飾的特定模式與結(jié)構(gòu)上存在微妙差異,，沒(méi)有工程化修飾過(guò)的CHO細(xì)胞不能合成某些人源聚糖鍵，比如：α-2,6-唾液酸化,、二分N聚糖和α-1,3/4-巖藻糖基化,，為了在CHO細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的蛋白的糖基化，不同的團(tuán)隊(duì)也開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的糖工程方法,。CHO細(xì)胞可以進(jìn)行高密度無(wú)血清懸浮培養(yǎng),，并將目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，因而是一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的大規(guī)模重組蛋白表達(dá)平臺(tái),。

CHO細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)可受到多種因素影響,，包括：表達(dá)質(zhì)粒、啟動(dòng)子的選擇,、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基成分,、溫度、溶氧）、CHO細(xì)胞系的選擇和表達(dá)系統(tǒng)的選擇等,。利用CHO細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白表達(dá)包括瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)兩種方式,。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中含有目的基因的cDNA會(huì)隨著細(xì)胞分裂而被稀釋，表達(dá)周期較短,。盡管瞬時(shí)表達(dá)的效率低于穩(wěn)定表達(dá),，但優(yōu)化策略后的蛋白產(chǎn)量也可高達(dá)1 g/L。而瞬時(shí)表達(dá)減少了與細(xì)胞系開(kāi)發(fā)相關(guān)的時(shí)間和成本,，被廣泛用于臨床前研究中蛋白的快速生產(chǎn),。CHO細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)則是大規(guī)模生物制造的標(biāo)準(zhǔn)方法。

蛋白亞單位疫苗是基于病原體的一種或幾種分離或選定的成分,，通常是免疫顯性抗原（全蛋白,、蛋白結(jié)構(gòu)域或多肽），可在佐劑刺激下使產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫,。蛋白亞單位疫苗因?yàn)闆](méi)有恢復(fù)到致病形式的風(fēng)險(xiǎn),，也被認(rèn)為比滅活疫苗或減毒活疫苗更安全。

蛋白亞單位疫苗已被批準(zhǔn)用于多種病毒感染性疾病的預(yù)防,，如：SARS-CoV-2,、水痘-帶狀皰疹病毒、呼吸道合胞病毒和流感,，劑量范圍從5到180 ug,。盡管新冠的蛋白亞單位疫苗應(yīng)用范圍沒(méi)有其他類型疫苗廣，但仍是目前臨床前和臨床候選疫苗的主要選擇,。蛋白亞單位疫苗的一個(gè)潛在挑戰(zhàn)是免疫原性較低,，這也凸顯了識(shí)別抗原以引起強(qiáng)大保護(hù)性免疫的重要性。

呼吸道合胞病毒是呼吸道感染的主要原因,，在幼兒、老年人和慢性病患者中可引起嚴(yán)重疾病,，2019年幼兒死亡人數(shù)超過(guò)100000人,，在高收入國(guó)家中造成2.2萬(wàn)到4.7萬(wàn)人死亡,。早期使用甲醛滅活的RSV疫苗，甲醛導(dǎo)致病毒抗原產(chǎn)生羰基集團(tuán),，阻礙了抗原在細(xì)胞質(zhì)中的加工,，產(chǎn)生了低親和力的抗體，從而導(dǎo)致了增強(qiáng)型的RSV疾病,，表現(xiàn)為：高燒,、支氣管炎和呼吸困難。目前RSV表面的病毒融合 (F) 蛋白作為疫苗開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn),，這種預(yù)融合穩(wěn)定形式的設(shè)計(jì)已被證明可以產(chǎn)生有效的中和抗體,。但也有研究表明，即使采用低劑量預(yù)融合F蛋白在動(dòng)物上也可能產(chǎn)生增強(qiáng)型RSV疾病,。

相比之下,，預(yù)融合的F蛋白在成人接種時(shí)表現(xiàn)出較好的結(jié)果，也導(dǎo)致葛蘭素史克開(kāi)發(fā)的RSV疫苗Arexvy疫苗 (RSVPreF3 OA) 的獲批上市,。該疫苗使用CHO細(xì)胞生產(chǎn),，由F蛋白的1-513號(hào)殘基組成，通過(guò)T4纖維蛋白結(jié)構(gòu)單元三聚體化,。預(yù)融合形式通過(guò)將F1的Ser155和Ser290替換為半胱氨酸而實(shí)現(xiàn),，在不穩(wěn)定的N端和結(jié)構(gòu)剛性中心區(qū)域之間建立了二硫鍵，另外引入S190F和V207L突變以填充F1N端空隙,，增加疏水相互作用,。在早期臨床試驗(yàn)展現(xiàn)良好的安全性，并確認(rèn)其誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的能力后,，和AS01E佐劑一起進(jìn)入了III期臨床,，在17個(gè)國(guó)家25000名60歲以上成年人中評(píng)估有效性。研究結(jié)果顯示,，單劑該疫苗對(duì)RSV相關(guān)的下呼吸道疾病的有效性為82.6%，對(duì)嚴(yán)重表現(xiàn)的有效性為94.1%,，對(duì)RSV相關(guān)急性呼吸道感染的有效性為71.7%,。

第二個(gè)獲批的RSV疫苗是輝瑞公司的Abrysvo，是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)的針對(duì)RSV A和B亞群的雙價(jià)融合前F蛋白,。在III期臨床中,，對(duì)RSV相關(guān)的下呼吸道疾病有66.7%的有效性，對(duì)嚴(yán)重RSV相關(guān)疾病有85.7%的有效性,，且嚴(yán)重不良事件發(fā)生率低,，安全性無(wú)明顯問(wèn)題。并且也作為孕婦疫苗進(jìn)行評(píng)估,，接種孕婦時(shí)間為妊娠第24-36周,，該疫苗顯示在新生兒出生后的前90天內(nèi),，預(yù)防嚴(yán)重RSV相關(guān)呼吸道疾病有81.8%的有效性，因此獲批做為預(yù)防嬰兒RSV的母親疫苗,。

以上兩個(gè)疫苗受到了市場(chǎng)的廣泛接受,，在三個(gè)月內(nèi)達(dá)到了12.35億美元的銷售額，也凸顯了CHO細(xì)胞在疫苗制備中的商業(yè)潛力,。

VZV可引起水痘,，是一種與典型皮疹和輕微癥狀相關(guān)的高度傳染性感染。初次感染后,，病毒可在神經(jīng)元中持續(xù)存在,，多年后重新激活會(huì)引起帶狀皰疹；重新激活后以皮疼痛性水皰性皮疹為特征,，在免疫受損的宿主中可能導(dǎo)致出血性病變,，最主要的并發(fā)癥為急性神經(jīng)炎和帶狀皰疹后神經(jīng)痛，影響50歲以上的25%-50%的患者,。

為了保護(hù)年長(zhǎng)或免疫缺陷的成年人,，重組VZV疫苗Shingrix于2017年由FDA獲批，一年后獲批EMA,。Shringrix是以VZV病毒表面普遍的gE蛋白為抗原,，是中和抗體和T細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵靶標(biāo)。該疫苗由CHO細(xì)胞生產(chǎn),，并由于去除了C端和跨膜結(jié)構(gòu)域而可以被分泌到細(xì)胞外,。在抗原產(chǎn)生過(guò)程中，CHO細(xì)胞的培養(yǎng)條件優(yōu)化后,，使用20 L的波浪式反應(yīng)器進(jìn)行批培養(yǎng),，最終每升產(chǎn)量在2.44 g。在50歲以上人群中,，有效性達(dá)97.2%以上,。

HCMV是一種感染了約80%人口的病原體，一旦個(gè)體免疫降低就會(huì)引發(fā)健康風(fēng)險(xiǎn),。并且也與各種癌癥進(jìn)展有關(guān),，其先天性感染也是出生缺陷的主要原因。即便如此,，目前也沒(méi)有批準(zhǔn)上市的疫苗,。但有幾款疫苗在臨床試驗(yàn)中，其中有幾款疫苗基于HCMV表面的gB蛋白由CHO細(xì)胞產(chǎn)生,，與病毒入侵過(guò)程中的膜融合至關(guān)重要,，并且包含中和抗體的多個(gè)識(shí)別表位，該蛋白與佐劑MF59正處于臨床II期進(jìn)行測(cè)試,。賽諾菲的gB基因來(lái)源于HCMV Towne毒株,，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和弗林切割位點(diǎn),。gB/MF59疫苗在移植后患者、產(chǎn)后婦女和健康的青春期女孩等不同受眾中均獲得了良好的效果,，結(jié)果顯示,，gB結(jié)合抗體滴度增加，CD4+T細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng),，HCMV病毒血癥降低,。

葛蘭素史克的另一款gB蛋白亞單位疫苗處于臨床I期試驗(yàn)中，抗原基于AD169毒株,，其修飾與賽諾菲相似,。另外，來(lái)自單純皰疹病毒1型的gD氨基酸序列融合在AD169 gB序列以促進(jìn)分泌,。

最近葛蘭素史克開(kāi)發(fā)的針對(duì)HCMV的新型佐劑,，由gB蛋白和五聚體抗原組成。HCMV五聚體復(fù)合物也是疫苗開(kāi)發(fā)中的具有吸引力的抗原,，相比于gB蛋白,，能誘導(dǎo)更有效的抗體中和進(jìn)入上皮細(xì)胞。因此,，葛蘭素史克使用CHO-K1和CHO-DXB11衍生的細(xì)胞克隆獲得400 mg/L的五聚體復(fù)合物,，并在小鼠中誘導(dǎo)了有效的中和免疫反應(yīng)。五聚體/gB 蛋白亞單位疫苗候選藥物目前正在健康成人受試者中進(jìn)行評(píng)估,。

即使在發(fā)現(xiàn)HIV病毒40年后,，HIV功能性疫苗的挑戰(zhàn)仍然存在，主要原因包括逆轉(zhuǎn)錄酶中缺乏3’核酸外切酶的校對(duì)活性,，使得病毒gp41和gp120可快速突變,。而中和抗體靶向的抗原表位位于HIV包膜蛋白的gp可變區(qū)域，在免疫系統(tǒng)的篩選壓力下也會(huì)導(dǎo)致突變體的產(chǎn)生,。

HIV env gp重組三聚體是目前作為疫苗開(kāi)發(fā)潛力的靶點(diǎn),，可能會(huì)引發(fā)廣泛的中和抗體。始終保持融合前構(gòu)象的早期可溶性三聚體稱為“SOSIP”,，其中包括gp120-gp41之間的工程化二硫鍵 (SOS) 以及有助于維持融合前構(gòu)象的螺旋斷裂突變（I559P,，稱為IP）。最近的臨床試驗(yàn)中的SOSIP三聚體已經(jīng)進(jìn)行了改進(jìn),，包括CHO細(xì)胞的改進(jìn)。其中某些env蛋白,，尤其是HIV分支B的env蛋白容易受蛋白水解影響,。為了解決這個(gè)問(wèn)題，采用了工程化的C1蛋白酶缺陷的CHO細(xì)胞系,，從而減少蛋白降解,。三聚體4571 (BG505 DS-SOSIP.664) 是基于HIV A分支的高度穩(wěn)定的與融合閉合可溶性包膜糖蛋白三聚體,。該三聚體在gp120中結(jié)合了201C-433C二硫鍵突變以防止CD4誘導(dǎo)的構(gòu)象變化。最近三聚體4571在I期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了獨(dú)立評(píng)估,，并在異源方案中作為加強(qiáng)劑量中做了評(píng)估,，結(jié)果顯示三聚體4571是安全的，沒(méi)有引起不良反應(yīng),，并能夠成功誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生,，主要是集中在三聚體上的無(wú)聚糖基底上的抗體。但是對(duì)于天然三聚體,，通常由于免疫系統(tǒng)無(wú)法接觸到無(wú)聚糖基底而導(dǎo)致其在臨床試驗(yàn)中具有更明顯的非中和反應(yīng),。為了減少這種基底定向免疫，未來(lái)CHO細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白亞基疫苗可以使用聚糖進(jìn)行工程設(shè)計(jì)以掩蓋三聚體基底結(jié)構(gòu)域,，減少非中和抗體的產(chǎn)生,。

SARS-CoV-2蛋白亞單位疫苗開(kāi)發(fā)廣泛使用的策略之一是使用S蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域 (ECD) 作為抗原。Medigen Vaccine Biologics Corporation開(kāi)發(fā)的MVC-COV1901疫苗基于融合前穩(wěn)定的S ECD三聚體,，該三聚體具有K986P和V987P突變,，以及在S1/S2連接處具有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)682突變 (RRAR>GGAS) ，以提高穩(wěn)定性并增加了T4纖維蛋白三聚體化結(jié)構(gòu)域,。CHO細(xì)胞用于生成表達(dá)該S抗原的穩(wěn)定克隆,，該抗原被證明類似于人HEK293細(xì)胞表達(dá)的SARS-CoV-2 S蛋白的結(jié)構(gòu)。該候選疫苗用氫氧化鋁（明礬）和CpG 1018佐劑,，CpG 1018是一種TLR-9激動(dòng)劑,，通過(guò)刺激CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)免疫原性。II期臨床試驗(yàn) (NCT04695652) 表明,，MVC-COV1901是安全的且耐受性良好,，并且在年輕人和老年人中都能誘導(dǎo)高中和抗體滴度。MVC-COV1901還與牛津-阿斯利康的ChAdOx1 nCoV-19病毒載體疫苗進(jìn)行了比較,，其中MVC-COV1901被證明,，可誘導(dǎo)更廣泛的IgG亞類和更高的抗Omicron (BA.1) 變體的中和抗體滴度。MVC-COV1901已獲準(zhǔn)在斯威士蘭,、巴拉圭,、索馬里蘭和中國(guó)臺(tái)灣使用。

SARS-CoV-2 S蛋白內(nèi)的受體結(jié)合域 (RBD) 是中和抗體的主要靶點(diǎn),。因此,，它已被用于生產(chǎn)各種蛋白亞單位疫苗,。已經(jīng)探索了不同的策略來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)其抗原性，例如使用單體,、二聚體或多聚體形式,。

ZIFIVAX (ZF2001) 疫苗由安徽智飛龍康生物制藥公司開(kāi)發(fā)，由三劑基于RBD的疫苗和明礬佐劑組成,。ZF2001是由兩個(gè)拷貝的RBD (R319-K537) 形成并在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)的二聚體,。這種RBD二聚體與RBD單體保持相似的親和力，而且能夠有效地與人ACE2受體結(jié)合,。在I期和II期臨床試驗(yàn)中,，ZF2001在人體中表現(xiàn)出安全特征和免疫原性。在多個(gè)國(guó)家/地區(qū)進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)顯示,，在接種疫苗后至少六個(gè)月內(nèi)對(duì)有癥狀和重度至危重,，ZF2001疫苗已獲準(zhǔn)在中國(guó)、哥倫比亞,、印度尼西亞和烏茲別克斯坦使用,。

CHO cells for virus-like particle and subunit vaccine manufacturing