大家好,，這里是專注表觀組學(xué)十余年,，多組學(xué)科研服務(wù)的易基因,。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物mRNA中的化學(xué)修飾,，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,。m6A是一種可逆修飾,，分別由甲基轉(zhuǎn)移酶(writer),、去甲基化酶(eraser)和m6A結(jié)合蛋白(reader)進(jìn)行添加,、去除和識(shí)別。

m6A檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展是研究m6A功能的基礎(chǔ),。薄層色譜（TLC）,、斑點(diǎn)印跡（dot-blots）以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）是廣泛用于檢測(cè)RNA m6A整體水平變化的方法。然而這些方法無法分析m6A在轉(zhuǎn)錄組水平上的分布,，也無法識(shí)別特定基因中的m6A位點(diǎn),。以下內(nèi)容將介紹關(guān)于高通量m6A測(cè)序技術(shù)和單基因m6A位點(diǎn)的檢測(cè)方法。

高通量m6A測(cè)序技術(shù)

盡管對(duì)于DNA化學(xué)修飾有許多檢測(cè)方法,，但開發(fā)用于RNA m6A測(cè)序方法還是存在一些困難,。首先，RNA不能直接擴(kuò)增,，必須首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,。但m6A結(jié)構(gòu)不影響正常堿基配對(duì)，m6A位點(diǎn)信息可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中丟失,。其次,，盡管m6A是真核mRNA中含量的修飾，但其含量非常低,，并且在細(xì)胞中仍有大量的核糖體RNA（rRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）干擾,。因此,，需要通過高度特異性的方法在復(fù)雜系統(tǒng)中富集m6A RNA。目前已經(jīng)開發(fā)出多種m6A的高通量測(cè)序技術(shù),，促進(jìn)了RNA修飾的功能研究,。

（1）抗體依賴性m6A測(cè)序方法

MeRIP-seq/m6A-seq 是使用m6A抗體開發(fā)的高通量測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)通過mRNA片段化成100-200個(gè)核苷酸（nt）,，然后與m6A抗體孵育,，洗脫的RNA用于構(gòu)建文庫(kù)和測(cè)序。甲基化區(qū)域在免疫沉淀RNA相對(duì)于input RNA的轉(zhuǎn)錄覆蓋率稱為peaks（圖1A）,。MeRIP-seq/m6A-seq 生成了約200個(gè)nt分辨率的m6A信息,。MeRIP-seq/m6A-seq操作簡(jiǎn)單，所有試劑均已商品化,；因此,，它一直是m6A測(cè)序的方法。

2021年有研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種升級(jí)版的MeRIP-seq/m6A-seq方法,，稱為m6A-seq2,。m6A-seq2不是一次對(duì)一個(gè)樣本進(jìn)行m6A免疫沉淀（m6A-IP），而是對(duì)合并RNA樣本進(jìn)行m6A-IP,。帶有條形碼的RNA接頭被連接到不同樣本的片段化RNA上,，然后在合并樣本上執(zhí)行單個(gè)抗m6A-IP，然后根據(jù)條形碼序列分配原始樣本的reads（圖1A）,。m6A-seq2所有m6A-IP都在單管中進(jìn)行,，可以減少技術(shù)變異性、樣本起始量和文庫(kù)制備成本,。此外,，考慮到不同樣本之間對(duì)固定數(shù)量抗體的競(jìng)爭(zhēng)，m6A-seq2可能能夠?qū)崿F(xiàn)不同樣本之間m6A整體水平的比較,。

m6A單堿基分辨率交聯(lián)和免疫沉淀方法（m6A-CLIP/miCLIP）可以成功生成單堿基分辨率的m6A位點(diǎn)信息,。該方法片段化的RNA與m6A抗體孵育，然后RNA-抗體復(fù)合物通過254 nm UV光交聯(lián),，通過蛋白酶消化得到的氨基酸殘基抑制逆轉(zhuǎn)錄中的堿基配對(duì),，導(dǎo)致在m6A位點(diǎn)附近發(fā)生片段化或突變，最終以單堿基分辨率獲得m6A位點(diǎn)信息（圖1A）,?？贵w和RNA的結(jié)合效率以及交聯(lián)效率將對(duì)最終的測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生重大影響。此外,，交聯(lián)主要發(fā)生在抗體的芳香族氨基酸和RNA的嘧啶堿基之間,。因此，m6A-CLIP/miCLIP不是直接鑒定單m6A位點(diǎn),，而是從相鄰嘧啶位點(diǎn)突變中進(jìn)行推斷,；無法準(zhǔn)確定位多個(gè)相鄰腺苷中的m6A,，且很難對(duì)群集m6A分布進(jìn)行分析。

圖1：高通量m6A測(cè)序技術(shù)

A. 基于抗體的m6A測(cè)序方法示意圖：MeRIP-seq/m6A-seq,、m6A-seq2和m6A-CLIP/miCLIP,。

B. 抗體非依賴性m6A測(cè)序方法示意圖：m6A SEAL-seq、m6A SAC-seq,、Nanopore Direct RNA-seq和GLORI-seq,。

（2）抗體非依賴性測(cè)序技術(shù)

基于抗體的m6A高通量測(cè)序技術(shù)存在明顯的缺點(diǎn)：m6A抗體質(zhì)量不易控制，使用不同制造商的抗體獲得結(jié)果差異較大,。此外,，抗體的高價(jià)格和測(cè)序所需的大量RNA也阻礙其大規(guī)模應(yīng)用。為了克服這些局限,，科研人員也提出了多種抗體非依賴性m6A高通量測(cè)序方法,。

FTO輔助的m6A選擇性化學(xué)標(biāo)記方法（m6A-SEAL-seq）利用去甲基化酶FT的特性,，在體外對(duì)m6A進(jìn)行標(biāo)記,。FTO用于將m6A氧化為中間產(chǎn)物hm6A，hm6A進(jìn)一步與二硫蘇糖醇（DTT）轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的N6-二硫代硫醇甲基腺苷（dm6A）,。然后用生物素標(biāo)記dm6A以富集含有原始m6A的RNA片段,。對(duì)富集的RNA進(jìn)行測(cè)序以獲得m6A位點(diǎn)信息（圖1B）。m6A-SEAL-seq所需初始RNA量很低,，FTO具有很強(qiáng)大的去甲基化活性,，幾乎沒有序列選擇性。m6A-SEAL-seq的缺點(diǎn)是操作步驟多,、耗時(shí)長(zhǎng),、分辨率與MeRIP-seq相似。

選擇性丙烯基化學(xué)標(biāo)記測(cè)序（m6A-SAC-seq）可以直接標(biāo)記m6A,，覆蓋幾乎所有m6A經(jīng)典motif,，并以單堿基分辨率定量分析捕獲的m6A位點(diǎn)。該方法使用特定酶將烯丙基化學(xué)基團(tuán)添加到m6A中,，形成a6m6A,，經(jīng)I2處理后進(jìn)行環(huán)化。在逆轉(zhuǎn)錄過程中,，環(huán)化的a6m6A被逆轉(zhuǎn)錄酶讀為突變,。基于突變位點(diǎn)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組中的m6A位點(diǎn),，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換突變率來獲得m6A含量的準(zhǔn)確信息（圖1B）,。m6A-SAC-seq可廣泛應(yīng)用于各種生物學(xué)背景，并在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用中具有良好前景,。m6A-SAC-seq的主要局限在于反應(yīng)基于酶,，因此可能具有序列偏好,。

納米孔直接RNA測(cè)序（Nanopore Direct RNA-seq）是另一種能夠以單堿基分辨率鑒定m6A修飾的測(cè)序技術(shù)。當(dāng)RNA通過納米孔時(shí),，通過納米孔表面的電場(chǎng)強(qiáng)度鑒定RNA序列,。RNA修飾導(dǎo)致強(qiáng)度水平變化，因此可以通過以單堿基分辨率計(jì)算確定修飾堿基（圖1B）,。盡管Nanopore Direct RNA-seq能夠在單堿基水平上鑒定m6A修飾,，但仍存在一些缺點(diǎn)，如成本高,、準(zhǔn)確性低,、對(duì)RNA質(zhì)量和初始量要求較高。

乙二醛和亞硝酸鹽介導(dǎo)的未甲基化腺苷脫氨酶測(cè)序（GLORI-seq）是最近報(bào)道的技術(shù),；它能夠高效且無偏倚檢測(cè)單堿基m6A位點(diǎn),，并定量m6A修飾水平。GLORI技術(shù)使用乙二醛和亞硝酸鹽的催化系統(tǒng)高效地將未甲基化腺苷脫氨形成肌苷（A到I,，>98%）,。肌苷在逆轉(zhuǎn)錄過程中與胞嘧啶匹配，隨后在測(cè)序過程中被讀為鳥苷（G）,，產(chǎn)生A-to-G轉(zhuǎn)化,。而m6A保持不變，在測(cè)序后仍被讀為A,。因此,，GLORI通過檢測(cè)測(cè)序reads中A的比例，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單堿基m6A的定量（圖1B）,。

單基因m6A位點(diǎn)的檢測(cè)

盡管高通量測(cè)序技術(shù)能夠快速獲得數(shù)千個(gè)m6A位點(diǎn)數(shù)據(jù),，但由于測(cè)序過程中的偏倚或技術(shù)原理上的缺陷，它們?nèi)匀粫?huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果,。因此,，有必要開發(fā)檢測(cè)單基因m6A位點(diǎn)的方法。

MeRIP-qRT-PCR已被廣泛用于驗(yàn)證高通量測(cè)序鑒定的m6A peaks,。mRNA或總RNA被片段化為100-200nt,，隨后用m6A抗體進(jìn)行免疫沉淀，富集的RNA通過常規(guī)qRT-PCR進(jìn)行定量（圖2）,。盡管MeRIP-qRT-PCR簡(jiǎn)單實(shí)用,，但它不能提供單堿基分辨率，并且依賴于m6A抗體的特異性,。

基于單堿基延伸和連接的qPCR擴(kuò)增方法（SELECT）利用m6A抑制DNA聚合酶和連接酶的特性,，方便快速地檢測(cè)特定位點(diǎn)的m6A修飾及程度。SELECT使用DNA聚合酶和連接酶連接靶位點(diǎn)的兩個(gè)互補(bǔ)DNA引物。在這個(gè)過程中,，m6A首先干擾上游引物的延伸,，然后阻礙下游引物的連接。盡管m6A不會(huì)抑制每一步,，但通過兩步反應(yīng)可以大幅減少最終產(chǎn)物量,。最終，通過qRT-PCR分析目標(biāo)位點(diǎn)和對(duì)照組的閾值循環(huán)（Ct）的差異,，可以檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)的m6A修飾和甲基化程度（圖2）,。SELECT操作簡(jiǎn)便，所有實(shí)驗(yàn)都可以在一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中完成,，無需額外的純化步驟,。但SELECT需要引入對(duì)照組并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以完成檢測(cè)和定量分析。

位點(diǎn)特異性切割和放射性標(biāo)記,，隨后通過連接輔助提取和TLC（SCARLET）可以以單堿基分辨率定量檢測(cè)RNA中的修飾位點(diǎn),，這目前是RNA修飾的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因?yàn)?span>RNase H會(huì)消化RNA/DNA雜交體中的RNA,，但不消化RNA/2-O-甲基化DNA雜交體中的RNA,，使用RNase H暴露于預(yù)定義的m6A位點(diǎn)進(jìn)行放射性標(biāo)記。使用DNA連接酶將32P標(biāo)記的RNA片段連接到116個(gè)核苷酸的單鏈DNA寡核苷酸上,。然后用RNase T1/A處理樣品以消化所有RNA,，而32P標(biāo)記的預(yù)定義m6A位點(diǎn)保持不變,。經(jīng)過凝膠純化和核酸酶P1消化后,，通過TLC確定m6A修飾狀態(tài)（圖2）。SCARLET技術(shù)的應(yīng)用受到其復(fù)雜步驟,、長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間和使用放射性試劑的限制,。

圖2：?jiǎn)位?span>m6A位點(diǎn)檢測(cè)方法

位點(diǎn)特異性m6A檢測(cè)方法示意圖：MeRIP-qRT-PCR、SELECT和SCARLET,。

總結(jié)而言,，目前已經(jīng)開發(fā)出的不同層面m6A修飾檢測(cè)方法主要有：

1）整體水平檢測(cè)：TLC、Dot-blot和LC-MS/MS,；

2）轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A修飾高通量檢測(cè)（圖1）：

a)基于特異性抗體的測(cè)序技術(shù)（MeRIP-seq/m6A-seq,、m6A-seq2、m6A-CLIP/miCLIP）,；

b)非抗體依賴的測(cè)序技術(shù)（m6A-SEAL-seq,、m6A-SAC-Seq、Nanopore Direct RNA Seq,、GLORI-Seq）,；

3)單基因m6A位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)：MeRIP-qRT-PCR、SELECT、SCARLET（圖2）,。

以上方法有不同的應(yīng)用場(chǎng)景,，科研老師們可以根據(jù)自己的科研需求選擇適合的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)：

Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023 May 8;4(3):100546. pii: S2590-3462(23)00044-5. doi: 10.1016/j.xplc.2023.100546. PubMed PMID: 36627844.