內(nèi)容

1.化學(xué)
2.液相合成
3.固相合成
3.1.中國銀行SPPS
3.2.Fmoc SPPS
4.固體支持物
4.1.聚苯乙烯樹脂
4.2.聚酰胺樹脂
5.保護(hù)團(tuán)體
5.1.Fmoc保護(hù)基團(tuán)
5.2.Boc保護(hù)基團(tuán)
5.3.芐氧羰基(Z)基團(tuán)
5.4.Alloc保護(hù)基團(tuán)
5.5.平版保護(hù)基團(tuán)
6.激活組
6.1.碳化二亞胺
6.2.芳香肟
7.合成長肽
8.固相肽合成的一個(gè)例子
9.參考

1.化學(xué)

肽是通過將一個(gè)氨基酸的羧基或C端偶聯(lián)到另一個(gè)氨基酸的氨基或N端而合成的。

2.液相合成

液相肽合成是肽合成的經(jīng)典方法。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中,，它已被固相合成所取代(見下文),。然而，它在用于工業(yè)目的的肽的大規(guī)模生產(chǎn)中仍然有用,。

3.固相合成

Merrifield固相肽合成(SPPS)導(dǎo)致了肽合成領(lǐng)域的范式轉(zhuǎn)變,。這是目前實(shí)驗(yàn)室以合成方式制造肽和蛋白質(zhì)的方法。SPPS允許合成難以在細(xì)菌中表達(dá)的天然肽,、摻入非天然氨基酸,、肽/蛋白質(zhì)骨架修飾以及合成由D-氨基酸組成的D-蛋白質(zhì)。

小珠子用接頭處理,，在接頭上可以構(gòu)建肽鏈,。合成珠將保持與肽的強(qiáng)結(jié)合，直到被試劑裂解,。珠子創(chuàng)造了一種合成環(huán)境,，在這種環(huán)境中，產(chǎn)生的肽鏈不會通過過濾材料,，而用于產(chǎn)生肽鏈的試劑會通過,。

重點(diǎn)考慮在每一步中產(chǎn)生高的產(chǎn)量。例如,，如果每個(gè)步驟具有99%的產(chǎn)率,，26個(gè)氨基酸的肽將以77%的最終產(chǎn)率合成，如果每個(gè)步驟是95%,，它將以25%的產(chǎn)率合成,。因此,，每一種氨基酸都是以大大過量(2 ~ 10倍)添加的，并且通過一系列充分表征的試劑將氨基酸偶聯(lián)在一起是高度優(yōu)化的

有兩種主要的SPPS形式——Fmoc和Boc。與核糖體蛋白質(zhì)合成不同,，固相肽合成以C-末端到N-末端的方式進(jìn)行,。氨基酸單體的N-末端被這兩個(gè)基團(tuán)保護(hù)，并被加到去保護(hù)的氨基酸鏈上,。

自動合成器可用于這兩種技術(shù),，盡管許多研究小組繼續(xù)手動執(zhí)行spp,。

SPPS受到產(chǎn)量的限制,，通常70~100個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的肽和蛋白質(zhì)正在推動合成可及性的極限,。合成難度也依賴于序列；典型的淀粉樣肽和蛋白質(zhì)很難制造,。通過使用天然化學(xué)連接將兩個(gè)肽偶聯(lián)在一起,，可以獲得更長的長度，并具有定量的產(chǎn)量,。

3.1.中國銀行SPPS

當(dāng)R. B. Merrifield在1963年發(fā)明SPPS時(shí),，它是根據(jù)tBoc方法。t-Boc(或Boc)代表叔丁氧羰基,。為了從生長的肽鏈上去除Boc,，使用酸性條件(通常是純TFA)。在合成結(jié)束時(shí),，通過在氫氟酸中孵育(這可能是危險(xiǎn)的),，從樹脂中除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和肽；由于這個(gè)原因,，Boc化學(xué)通常不受歡迎,。然而，對于復(fù)雜的合成,，Boc是有利的,。當(dāng)合成對堿基敏感的非天然肽類似物(如depsi肽)時(shí)，Boc是必需的,。

4.固體支持物                        

固相支持物的物理性質(zhì)及其可用于的應(yīng)用,，隨著構(gòu)建支持物的材料、交聯(lián)的量以及所用的接頭和手柄而變化,。

4.1.聚苯乙烯樹脂

這是一種多功能樹脂,，由于其在DCM中的溶脹最小，因此在多孔自動化肽合成中非常有用,。

4.2.聚酰胺樹脂

這也是一種有用和多用途的樹脂,。它似乎比聚苯乙烯膨脹得多,，在這種情況下,，如果孔太小，它可能不適合一些自動合成器,。

5.保護(hù)團(tuán)體

由于在每個(gè)合成步驟中使用過量的氨基酸來確保偶聯(lián),，在每個(gè)氨基酸未被保護(hù)的反應(yīng)中，氨基酸的聚合是常見的,。為了防止這種聚合,，使用了保護(hù)基團(tuán)。這給合成反應(yīng)增加了額外的去保護(hù)階段,，產(chǎn)生了如下的重復(fù)設(shè)計(jì)流程:

• 在去保護(hù)反應(yīng)中，保護(hù)基團(tuán)從尾部氨基酸中被除去

• 洗去脫保護(hù)試劑以提供清潔的偶聯(lián)環(huán)境

• 溶解在溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)中的受保護(hù)的氨基酸與偶聯(lián)劑混合,，泵送通過合成柱

• 洗去偶聯(lián)試劑以提供干凈的去保護(hù)環(huán)境

目前,，固相肽合成中通常使用兩種保護(hù)基團(tuán)(Fmoc，Boc),。它們的不穩(wěn)定性是由氨基甲酸酯基團(tuán)引起的,，氨基甲酸酯基團(tuán)容易釋放CO2用于不可逆的解偶聯(lián)步驟。

5.1.Fmoc保護(hù)基團(tuán)

Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)是目前廣泛使用的保護(hù)基團(tuán)，其通常在從氨基酸單元重復(fù)合成肽的過程中從肽的N末端除去,。Fmoc的優(yōu)點(diǎn)是它在非常溫和的堿性條件下(例如哌啶)被裂解,，但在酸性條件下穩(wěn)定。這使得在堿性條件下穩(wěn)定的溫和的酸不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán),，例如Boc和芐基,，被用于目標(biāo)肽的氨基酸殘基的側(cè)鏈上。這種正交保護(hù)基策略在有機(jī)合成領(lǐng)域很常見。

5.3.芐氧羰基(Z)基團(tuán)

另一種基于氨基甲酸酯的基團(tuán)是芐氧羰基(Z)基團(tuán)。它在更苛刻的條件下被去除:溴化氫/乙酸或催化氫化,。今天,，它幾乎用于側(cè)鏈保護(hù)。

5.4.Alloc保護(hù)基團(tuán)

當(dāng)需要鄰位去保護(hù)方案時(shí)，烯丙氧基羰基(alloc)保護(hù)基團(tuán)通常用于保護(hù)羧酸,、羥基或氨基,。有時(shí)在進(jìn)行樹脂上環(huán)肽形成時(shí)使用，其中肽通過側(cè)鏈官能團(tuán)與樹脂連接,?？梢允褂盟?三苯基膦)鈀(0)以及氯仿、乙酸和N-甲基嗎啉(NMM)的37∶2∶1混合物2小時(shí)來除去alloc基團(tuán),。然后,，必須用0.5 % DIPEA的DMF溶液、3×10ml 0.5%二乙基硫代氨基甲酸鈉的DMF溶液以及5×10ml 1:1 DCM:DMF溶液仔細(xì)清洗樹脂。

5.5.平版保護(hù)基團(tuán)

對于特殊應(yīng)用,，如蛋白質(zhì)微陣列，使用平版印刷保護(hù)基團(tuán),。這些基團(tuán)可以通過曝光去除,。

6.激活組

為了偶聯(lián)肽,，羧基通常被活化,。這對加速反應(yīng)很重要。有兩種主要類型的活化基團(tuán):碳二亞胺和芳香肟,。

6.1.碳化二亞胺

這些活化劑最初是被開發(fā)出來的。最常見的是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二異丙基碳二亞胺(DIC),。與羧酸反應(yīng)生成高活性的O-?；濉Ｔ谌斯さ鞍踪|(zhì)合成過程中(如Fmoc固態(tài)合成儀),，C末端通常用作氨基酸單體添加的附著位點(diǎn),。為了增強(qiáng)羧酸基團(tuán)的親電性,，帶負(fù)電荷的氧必須首先被“活化”成更好的離去基團(tuán)。DCC用于此目的,。帶負(fù)電荷的氧將充當(dāng)親核試劑,，攻擊DCC中的中心碳。DCC暫時(shí)連接到以前的羧酸酯基團(tuán)(現(xiàn)在是酯基團(tuán)),，使得氨基(在連接的氨基酸上)對以前的C-末端(碳?；?的親核攻擊更有效。碳二亞胺的問題是它們反應(yīng)性太強(qiáng),，因此會導(dǎo)致氨基酸的外消旋化,。

最新的發(fā)展省略了碳二亞胺,。活性酯作為非親核陰離子(四氟硼酸鹽或六氟磷酸鹽)的脲鹽或鏻鹽引入:HBTU,、HATU,、PyBOP。

7.合成長肽

逐步延伸，其中氨基酸逐步依次連接,，對于含有2至100個(gè)氨基酸殘基的小肽是理想的,。另一種方法是片段縮合，其中肽片段被偶聯(lián),。雖然前者可以延長肽鏈而不發(fā)生外消旋化,，但如果僅用于產(chǎn)生長肽或高極性肽，產(chǎn)量會下降,。對于合成復(fù)雜的長肽來說,，片段縮合比逐步延伸更好，但是為了防止外消旋化,，必須限制它的使用,。片段縮合也是不希望的，因?yàn)榕悸?lián)的片段必須大大過量,，這可能是一個(gè)取決于片段長度的限制,。

產(chǎn)生更長肽鏈的一個(gè)新進(jìn)展是化學(xué)連接:未保護(hù)的肽鏈在水溶液中發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)。第一個(gè)動力學(xué)控制的產(chǎn)物重排形成酰胺鍵,。最常見的天然化學(xué)連接形式使用與末端半胱氨酸殘基反應(yīng)的肽硫酯,。

8.固相肽合成的一個(gè)例子

以下是使用堿不穩(wěn)定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)在聚酰胺或聚苯乙烯樹脂上合成肽的合成步驟的概述,。使用下面概述的技術(shù)，將獲得在N-末端用乙?；舛?，在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。

為手動肽合成設(shè)置玻璃器皿

手動肽合成可以在具有三通閥的燒結(jié)過濾器反應(yīng)容器中完成,，該三通閥通過1孔塞子安裝在1 L側(cè)臂真空燒瓶上,。一個(gè)閥門用于充入氮?dú)猓獨(dú)馐紫韧ㄟ^一個(gè)小的Drierite柱,，然后進(jìn)入反應(yīng)混合物以攪拌溶液和混合試劑,。另一個(gè)閥門用于排空過量的反應(yīng)溶液，并使用真空瓶洗滌溶劑,。用于固相合成的所有玻璃片應(yīng)在使用前用硅烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)處理,，以避免靜電荷的積累，靜電荷的積累會使樹脂很難處理,。

聚酰胺樹脂的制備

聚酰胺(PL-DMA)樹脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過夜,，然后過濾，用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液,、5×10ml 1:1 DCM洗滌,，并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥,，并儲存在-15攝氏度,，直到需要。

在合成前和合成過程中處理樹脂

樹脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鐘,，然后瀝干。每次完成氨基酸偶聯(lián)后,，還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹脂,。

Fmoc-去保護(hù)

每次氨基酸偶聯(lián)后,，用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc去保護(hù),，每次處理用N2攪拌10分鐘。然后用5×10毫升DMF洗滌樹脂,，接著用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌,。

添加氨基酸

為了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹脂上開始肽合成，通過用哌啶處理樹脂來除去Fmoc基團(tuán),。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq),、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)至樹脂的Fmoc-去保護(hù)的N-末端胺，或之前偶聯(lián)的氨基酸,，直到樹脂對茚三酮呈陰性,。

監(jiān)測氨基酸偶聯(lián)的進(jìn)展

氨基酸偶聯(lián)的過程可以用茚三酮或?qū)β弱珌砀櫋＼崛芤涸谟坞x伯胺的存在下變成深藍(lán)色(陽性結(jié)果),，但在其他情況下是無色的(陰性結(jié)果),。如果使用乙醛作為溶劑，在伯胺的存在下,，或者如果使用丙酮,，在仲胺的存在下，對-氯醌溶液將使樹脂珠變成深黑色或藍(lán)色,；否則珠子保持無色或淡黃色,。(測試概述如下)

茚三酮測試(1)

向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液,、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液,，以及抹刀一端大小的樹脂樣品，然后渦旋混合物,，并在100°c下加熱5分鐘

用氯醌測試(2)

向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛,、5滴對氯醌的甲苯飽和溶液,，以及小刮刀一端大小的樹脂樣品，然后渦旋混合物,，并在室溫下靜置5分鐘,。丙酮用于檢測仲胺，乙醛用于檢測伯胺,。

持續(xù)肽延伸

一旦氨基酸的偶聯(lián)完成，就洗滌樹脂,，用哌啶去保護(hù)Fmoc基團(tuán)，并再次洗滌樹脂,，為下一次偶聯(lián)做準(zhǔn)備,。重復(fù)這一過程，直到添加完所有必需的氨基酸,。

乙酰化N-末端

肽序列完成后,，可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙?；疦-末端胺1小時(shí)或直到茚三酮陰性，然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹脂,，然后將肽從樹脂上切下,。如果需要，N-末端也可以作為游離胺留下,。

從樹脂上切割肽

用3×10ml 96∶2∶2的TFA,、三異丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)處理樹脂，每次處理10分鐘,，然后過濾掉樹脂,，將合并的濾液靜置1小時(shí)，以確保除去酸不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán),。

從樹脂上切割后肽的處理

將TFA在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干(或重油或玻璃,，如果它不凝固的話),，隨后向燒瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽，并除去大部分副產(chǎn)物,。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中,，并以3000 rpm的速度旋轉(zhuǎn)10-20分鐘(IEC離心機(jī)),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的后,，通過渦旋使肽重新懸浮,。再次離心混合物，倒出,，洗滌過程重復(fù)兩次以上,。最后，產(chǎn)品可以在脫粘器中的Falcon管中風(fēng)干過夜,。

通常使用制備型HPLC來純化最終產(chǎn)物,。獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)以確保獲得目標(biāo)肽,。