流動(dòng)相是影響液相色譜的關(guān)鍵因素,。一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度,、與檢測器兼容性好,、易于得到純品和低毒性等特征,。高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑,、有機(jī)溶劑或它們的混合液，但是如何配制,。選擇配制的方法不同,，分析結(jié)果特別是保留時(shí)間，是會(huì)有顯著差別的,。

高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑,、有機(jī)溶劑或它們的混合液，水性溶劑也常用于緩沖液,。常因資料上表示的內(nèi)容和實(shí)際的配制方法不同,，而產(chǎn)生流動(dòng)相的差異，影響了色譜圖和分析結(jié)果,。

一般來說,，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）進(jìn)行。溶液的體積因溫度而變化,，所以按重量比混合可調(diào)制再現(xiàn)性較好的混合溶劑,，但由于操作較麻煩，通常多用體積比混合,。只要沒有特別標(biāo)明,，就可按體積比進(jìn)行混合，但在特殊情況下,，如胺類粘度高的溶液混合時(shí),，有時(shí)用重量—體積比（W/V）的方法。

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

a,、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。流動(dòng)相溶解度達(dá)不到要求時(shí),，盡量選用流動(dòng)相中含有的比例較大的成分,，以減輕進(jìn)樣對(duì)流動(dòng)相的影響造成基線不穩(wěn)。

b,、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng),，選用流動(dòng)相配置對(duì)色譜峰影響小。

c,、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果,；降低柱壓降,，延長泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

d,、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng),。如使用UV檢測器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制,。流動(dòng)相組成溶劑均達(dá)不到要求時(shí),，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長內(nèi)無紫外吸收。

e,、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行,。

f,、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣,。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測,，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

下面21項(xiàng)注意讓你更懂液相流動(dòng)相,。

1,、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意過濾溶劑 

溶劑在使用前一定要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學(xué)試劑（緩沖鹽）配制流動(dòng)相,，過濾特別重要,，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過濾片,。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇（反光面朝上）,，過濾水溶性流動(dòng)相時(shí)（如甲醇/水），先用1～2mL甲醇潤濕過濾膜,，有助于快速抽濾,。

2、注意保持儲(chǔ)液瓶的清潔 

用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，末次應(yīng)用HPLC級(jí)的水或溶劑清洗,，不能在清洗過程中留下污跡,。

3、注意保證溶劑的質(zhì)量 

一定要用HPLC級(jí)的溶劑,，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí),，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。

4,、注意流動(dòng)相脫氣不充分

流動(dòng)相受熱,，或者流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動(dòng),，增加噪音,，色譜圖上出現(xiàn)毛刺?？稍囉孟铝蟹椒ń鉀Q問題：流動(dòng)相再脫氣,；采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合,。HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣,，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作,。

系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：流動(dòng)相本身存在,，梯度淋洗混合后放出氣泡；

氣泡的影響：存在于管路中,，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；存在于單向閥中,，易造成液體回流,，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液存在于檢測器中,，出現(xiàn)鬼峰,，影響檢測準(zhǔn)確性。所以做液相對(duì)流動(dòng)相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格,。氣泡會(huì)影響柱的分離效率,，檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性,，甚至使無法檢測,。（噪聲增大，基線不穩(wěn),，突然跳動(dòng)）,。

此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng),。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化,，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如,，甲醇,、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下）,，并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低,，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）,。在熒光檢測中,，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴,、脂肪醛、酮等,。在某些情況下,，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法）,，氧的影響更大,。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度,。

常用的脫氣方法有：加熱煮沸,、抽真空、超聲,、吹氦等,。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法,，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化,。

（1）氦氣脫氣：氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動(dòng)相趕去溶入的空氣,，如果使用得當(dāng),，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶入氣體。由于氦氣在流動(dòng)相中的溶解度極低,，所以用氦氣脫氣保護(hù)的流動(dòng)相可以認(rèn)為是一個(gè)無氣體溶解體系,。其缺點(diǎn)是氦氣價(jià)格比較昂貴，會(huì)增加檢驗(yàn)成本,。一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除,，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時(shí)經(jīng)常使用,。但氦氣昂貴,，難于普及。

（2）真空脫氣：也是比較常用的脫氣方法?，F(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都用這種辦法,，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出,，其效果僅次于氦氣脫氣,。象Agileng1200液相色譜使用的是在線脫氣機(jī)。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動(dòng)相,，在使用過程中的微量脫氣,。

（3）超聲波脫氣：將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡便,，又基本上能滿足日常分析操作的要求,，所以，目前仍廣泛采用,。這種方法只能除去30%的溶解氣體,，有時(shí)還會(huì)引起氣體溶解度的增加。對(duì)氧敏感的檢測器不宜用此法,。
超聲脫氣比較好,，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），關(guān)于超聲時(shí)間問題眾說紛紜,，各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)5～30分鐘不等,，一般來說流動(dòng)相組成為無機(jī)（緩沖鹽溶液）時(shí)，5～15分鐘即可,，流動(dòng)相為是水和有機(jī)容積混合時(shí),，超聲時(shí)間要相對(duì)長一些，這個(gè)方法只能除去30%的溶解氣體,，時(shí)間的延長不和效果成正比,，且其中氣泡對(duì)色譜峰基線穩(wěn)定性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大,，15min超聲即可足夠,。此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸,，以免玻璃瓶破裂,，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

（4）加熱回流脫氣：該方法雖然效果很好,，但是適用范圍較窄,。對(duì)于有機(jī)溶劑或混合流動(dòng)相不適合用此法,，因?yàn)閾]發(fā)性組分會(huì)損失掉，改變流動(dòng)相的組成,。

綜合來說,，用真空抽濾后，再用超聲脫氣的辦法,，用氦氣的方法是效果好的辦法,，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可以放到儀器上使用,，是一種保證性的辦法,。

A.離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后,，氣體立即開始回到溶劑中,。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和,。

B.在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn),。用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí),，將惰性氣體噴入溶劑中,。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣,，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來,。此外還有在線脫氣機(jī),。

5,、注意流動(dòng)相供給不暢

流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn),。應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中流動(dòng)相的量,，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底,，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管,，使其不能上下移動(dòng)。

過濾器阻塞引起管道和泵腔空化,，壓力不穩(wěn),。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常,，說明已找出問題,，換上新的過濾器則可。有時(shí)候換上新的過濾器仍然不暢,，那就需要查查流動(dòng)相的制備過程,，或者換大孔徑的過濾器,。不管如何，流動(dòng)相都需要重新過濾,。流速過高,、阻力大，造成空化現(xiàn)象,，這是由于過濾器孔徑,、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的,。如果流速大于10mL/min,，常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。

使用下列方法解決：（1）使用低流速,；（2）換大孔徑的過濾器,；（3）增加進(jìn)液管道內(nèi)徑；（4）抬高或加壓儲(chǔ)液器,；（5）不用過濾器,，但流動(dòng)相一定要先過濾；（6）儲(chǔ)液器蓋子太緊,，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空,，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙,；（7）進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液,，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動(dòng),、泵部件損壞等,，都能引起供液不正常。

6,、注意防止流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染

由于污染,，噪音越來越大，檢測器基線上升,。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng),，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰,。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂,，流動(dòng)相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線噪音突然增大或突然提高,，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久（通宵）所造成的,。

新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長霉，繁殖了細(xì)菌,。臟的儲(chǔ)液器會(huì)污染清潔的流動(dòng)相,。每種流動(dòng)相備有專用的儲(chǔ)液器,，或者定期報(bào)廢儲(chǔ)液器。

流動(dòng)相污染來自這幾個(gè)方面：試劑質(zhì)量不高,，玻璃器皿不合格,；微生物的影響；配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)?/span>,，因此要求高純度化學(xué)試劑和HPLC級(jí)溶劑,。要注意玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈；為防止微生物生長,，每天要用甲醇清洗系統(tǒng),；懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長了微生物，可用稀硝酸沖洗即可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）,；真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)相,；用清潔的惰性塞子、攪棒,、過濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相,；已經(jīng)污染的流動(dòng)相一定要廢棄掉。

7,、注意選擇流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)

低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮,，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng),。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁,、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

8,、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意純度

色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān),，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

9,、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意必須與檢測器匹配

使用UV檢測器時(shí),，所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收,，或吸收很小,。當(dāng)使用示差折光檢測器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相,，以提高靈敏度,。

10、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粘度要低（應(yīng)<2cp）

高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散,、傳質(zhì),，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加,，使分離時(shí)間延長,，選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相,。

11、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意對(duì)樣品的溶解度要適宜

如果溶解度欠佳,，樣品會(huì)在柱頭沉淀,，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化,。

12,、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意樣品易于回收

應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑

13、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意由強(qiáng)到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn),，這樣可以很快地得到分離結(jié)果,，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

14,、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意三倍規(guī)則

每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量,，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則,。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法,。調(diào)整的過程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況,。

15,、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率,，直至各組分的分離情況不再改變。

16,、流動(dòng)相的配制注意有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合方法

有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合液作為流動(dòng)相是經(jīng)常的,，但由于混合方法不同，有時(shí)分析結(jié)果相差很大,。如20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%與乙腈10%的混合液,，混合比為9∶1時(shí)，20mM 磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%與乙腈10%的體積比為9∶1,，也就是可以解釋為各自按體積比例的相當(dāng)量稱取后進(jìn)行混合,。另外，按10%乙腈解釋,，用20mM 磷酸鈉緩沖液（pH2.5）,，將乙腈稀釋調(diào)制也可以成立。在后者情況下,，產(chǎn)生混合體積減少部分,，余下的添加20mM 磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒有太大的差別,，但由于混合方式不同,，分析結(jié)果,，特別是保留時(shí)間，也會(huì)有顯著的差別,，這點(diǎn)必須注意,。

17、50%或（V/V＝1/1）乙腈水溶液的配制方法

對(duì)于用V/V＝1/1的表示配制乙腈水溶液,，多按這種方法進(jìn)行：用量筒測定乙腈500mL,，用另一量筒測定水500mL，兩種液體在瓶內(nèi)充分搖晃混合,。不過50%乙腈水溶液的表示時(shí),，同樣也多是按上述方法配制，但查化學(xué)辭典時(shí),，實(shí)際上是按這種方法進(jìn)行配制：首先將500mL乙腈,，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水,，等待液溫達(dá)到室溫,，用全量水，使溶液到1L,。這樣一來,，用%表示和“V/V”體積比表示，得出的流動(dòng)相組成不同,。
也就是說,，混合溶劑的密度，與由原溶劑密度計(jì)算的單純平均值不相同,，所以用上述兩種方法調(diào)制的流動(dòng)相組成差異,。如在室溫（25℃）附近水50mL和乙腈50mL混合時(shí)體積不是100mL，而有所減少,，約為96mL,。在一般情況下，多用操作簡便的第一種方法,。

18,、流動(dòng)相的配制注意溶劑體積的溫度影響

溶液的密度受周圍溫度的影響。剛從溶劑冷藏箱拿出來的溶液溫度與實(shí)驗(yàn)室的室溫相比,，要低不少,，乙腈和水混合液因發(fā)熱反應(yīng),，溶液溫度升高,。因此，為能調(diào)制再現(xiàn)性好的流動(dòng)相,，建議在使用前用恒溫水浴鍋將液溫調(diào)到接近室溫,。

19,、流動(dòng)相的配制注意用兩臺(tái)泵進(jìn)行溶劑混合

雙泵主要是在探討流動(dòng)相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相色譜儀條件時(shí),，建議配好后使用的話,，混合比較均勻，效果較好,。在反相分析中,，常用的有機(jī)溶劑和水的等濃度法，使用高壓兩元梯度系統(tǒng),，用兩臺(tái)泵將流動(dòng)相分別輸液后混合等封閉式混合時(shí)與預(yù)先在瓶內(nèi)混合后用1臺(tái)泵輸液時(shí),，因混合后體積變化的不同，保留時(shí)間也有所不同,，一定要注意,。不僅是流動(dòng)性的調(diào)制方法，試樣溶液和其他溶液的調(diào)制也經(jīng)常有上述問題,，另外,，在不同部門（醫(yī)藥部門或化工部門）各自都有自己的常識(shí)和習(xí)慣。在這種情況下,，就要求各部門在制作相關(guān)溶液配制方法時(shí)能規(guī)定通則,，定義設(shè)計(jì)溶液的調(diào)制方法，這樣避免混亂,，以在日常工作中更好地記住這些表示方法,。

20、注意流動(dòng)相的pH

 如需在一定PH值下操作,，須定期測定流動(dòng)相的PH值,，大氣中的CO2溶解在流動(dòng)相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時(shí)這種影響可能更大,。

21,、注意更換柱子及流動(dòng)相

軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時(shí)應(yīng)先用25~30倍柱容積的合適流動(dòng)相平衡,。更換流動(dòng)相時(shí),，如果兩種流動(dòng)相不互溶，需采用過渡溶劑使前一種流動(dòng)相逐步溶解除去,。例如,，2、2,、4-三甲基戊烷換成甲醇時(shí),，必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡，直到標(biāo)準(zhǔn)物保留值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

選擇合適的流動(dòng)相,，是保證色譜分離工作順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一,，希望以上內(nèi)容能夠幫助正在做高效液相色譜實(shí)驗(yàn)的你做出的選擇。