1,、western blot 的優(yōu)點(diǎn)

答：靈敏,，可達(dá)ng級，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級,。方便,，特異性高。

2,、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白,？

答：原因有很多：

a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞,；

b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了,，你必須加入PMSF,，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗體不能識別目標(biāo)蛋白,，多看看說明,，看是否有問題。

3,、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀,，有的很清亮，為什么呢,？

答：a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完,，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長,， b) 也不排除你的抗原濃度過高,，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。

4,、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請問怎么做WB,？

答：可以選擇0.2μml的膜,，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起,，再轉(zhuǎn)移,。其他按步驟即可。

5,、我的目的帶很弱,，怎么加強(qiáng)？

答：可以加大抗原上樣量,。這是最主要的,。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。

6,、膠片背景很臟,，有什么解決方法？

答：減少抗原上樣量,，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度,。

7,、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景,，是為什么,？

答：你的一抗?jié)舛容^高,，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn),，反應(yīng)時(shí)間不長,，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”,。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。

8,、我的膠片是一片空白,，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上,。

a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng),，將底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2,，不穩(wěn)定,，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置,；

d) 二抗失活。

9,、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了,，可以在黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時(shí)間過長,。

10,、DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒,，但是比較靈敏,，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制,，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn),，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏,，可以檢測pg 級抗原,。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。

11,、抗原檢測出的分子量比資料上的大,，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚體,。增多巰基乙醇量,，煮沸變性時(shí)間延長,，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化,，磷酸化等,。

12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,，但膠上有,，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么,？

答：可能是：a)樣品濃度過低,；b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。

13,、磷酸化抗體的檢測樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等,？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加,。但是不加也可以,，大部分時(shí)候是不用加的。

14,、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在,，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎,？

答：① 免疫組化可以用來進(jìn)行定位,，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性,，不易與背景區(qū)分,；Western blot可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量,，但是不能定位,。

② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn),，在免疫組化時(shí),，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15,、做Western Blot時(shí),，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗,，開始還有點(diǎn)痕跡,，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行,。是什么原因,？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

答：懷疑是樣品問題,，可能是：

1,，樣品不能反復(fù)凍融；

2,，樣品未加蛋白酶抑制劑,。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程,， 提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了,，最好能多加幾種蛋白酶抑制劑,。

16、細(xì)胞水平要做western blot,，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot,？

答：一般5×10^6就足夠了。

17,、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么,？這樣對western blot有無影響？

答：能,，沒有問題,。

18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎,？

答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品,。

19,、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么,？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白,，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性,。

20,、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克,，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決,？

答：你可以加大上樣量,，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長時(shí)間,，加20％甲醇,。