干貨:WB, IHC實(shí)驗(yàn)問(wèn)題總結(jié)與處理方案
1、western blot 的優(yōu)點(diǎn)
答:靈敏,,可達(dá)ng級(jí),,用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級(jí)。方便,,特異性高,。
2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白,?
答:原因有很多:
a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì),,換一種細(xì)胞;
b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了,,你必須加入PMSF,,抑制蛋白酶活性,;
c) 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白,多看看說(shuō)明,,看是否有問(wèn)題,。
3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀,,有的很清亮,,為什么呢?
答:a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性完,,可以適當(dāng)提高SDS 濃度,,同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng), b) 也不排除你的抗原濃度過(guò)高,,這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可,。
4、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD),,請(qǐng)問(wèn)怎么做WB?
答:可以選擇0.2μml的膜,,同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間,。也可以將兩張膜疊在一起,再轉(zhuǎn)移,。其他按步驟即可,。
5、我的目的帶很弱,,怎么加強(qiáng),?
答:可以加大抗原上樣量。這是最主要的,。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低,。
6、膠片背景很臟,,有什么解決方法,?
答:減少抗原上樣量,降低一抗?jié)舛?,改變一抗孵育時(shí)間,,提高牛奶濃度。
7,、目標(biāo)帶是空白,,周?chē)斜尘埃菫槭裁矗?/span>
答:你的一抗?jié)舛容^高,,二抗上HRP 催化活力太強(qiáng),,同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn),,反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng),將周?chē)孜锎呋?,形成了空白即“反亮現(xiàn)象”,。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物,。
8,、我的膠片是一片空白,是怎么回事,?
答:如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上,。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng),將底物消耗光,;
b) ECM底物中H2O2,,不穩(wěn)定,失活,;
c) ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置;
d) 二抗失活,。
9,、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答:a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來(lái)就被曝光了,,可以在黑暗的情況下操作.看是否有改善.,;b) 顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
10,、DAB好還是ECM好,?
答:DAB 有毒,,但是比較靈敏,,是HRP 最敏感的底物,;ECM結(jié)果容易控制,但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn),,但如果達(dá)到閥值,就特別靈敏,,可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況,。
11,、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大,是怎么回事,?
答:a)抗原形成了二聚體,。增多巰基乙醇量,煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng),,可以打開(kāi)二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,,磷酸化等,。
12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,,但膠上有,,同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了,為什么,?
答:可能是:a)樣品濃度過(guò)低,;b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。
13,、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等,?
答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般最好加,。但是不加也可以,,大部分時(shí)候是不用加的。
14,、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在,,需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎?做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎,?
答:① 免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位,,但是不能精確定量,而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性,,不易與背景區(qū)分,;Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子,進(jìn)行定量,,但是不能定位,。
② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用,公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn),,在免疫組化時(shí),,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時(shí),,提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),,用的博士德的一抗,開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡,,現(xiàn)在越來(lái)越差,,上樣量已加到120μg,換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行,。是什么原因,?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?
答:懷疑是樣品問(wèn)題,,可能是:
1,,樣品不能反復(fù)凍融;
2,,樣品未加蛋白酶抑制劑,。同時(shí),建議檢查Western Blot過(guò)程,, 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō),一般加PMSF就可以了,,最好能多加幾種蛋白酶抑制劑,。
16、細(xì)胞水平要做western blot,,多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot,?
答:一般5×10^6就足夠了。
17,、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么,?這樣對(duì)western blot有無(wú)影響,?
答:能,,沒(méi)有問(wèn)題。
18,、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎,?
答:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品,。
19,、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么,?
答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,,所用的去垢劑要溫和得多,這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20,、我的樣品的蛋白含量很低,,每微升不到1微克,但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,,就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決,?
答:你可以加大上樣量,,沒(méi)有問(wèn)題,還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間,,加20%甲醇,。
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