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細胞凋亡（Apoptosis）,，作為一種深入研究的程序性細胞死亡形式，近年來已成為生物學(xué)領(lǐng)域的熱門課題,。如果你的研究涉及癌癥機制與療法,、藥物篩選與藥理作用、生物發(fā)育,、免疫學(xué)或神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域,，細胞凋亡檢測無疑是你實驗設(shè)計中重要的一環(huán)。
在本期的細胞學(xué)堂中,，我們將深入介紹不同類型凋亡檢測試劑盒的相關(guān)知識,，并分享一些關(guān)于如何選擇凋亡檢測試劑盒的經(jīng)驗，旨在幫助您輕松理解并為您的樣本選擇合適的凋亡檢測試劑盒,。
凋亡細胞在細胞形態(tài)和生理上與壞死細胞和正常細胞存在顯著不同,，其細胞膜、細胞質(zhì),、細胞核,、核酸以及凋亡相關(guān)蛋白都發(fā)生明顯變化,，具有鮮明特征,。這些差異為我們提供了檢測細胞凋亡的多種方法。常用的細胞凋亡檢測方法包括形態(tài)學(xué)觀察,、細胞膜磷脂外翻檢測,、凋亡相關(guān)蛋白檢測,、DNA斷裂檢測、細胞周期分析等,。這些方法各有特點,，可以根據(jù)實驗需求和條件選擇合適的檢測方法。
根據(jù)細胞凋亡的機制和特點,，普諾賽®自主研發(fā)了Annexin V凋亡檢測試劑盒,、TUNEL凋亡檢測試劑盒、Caspase活性檢測試劑盒和線粒體膜電位(JC-1)檢測試劑盒,。
檢測原理：Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力。在正常細胞中,，PS通常位于細胞膜內(nèi)側(cè),。然而，當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時,，細胞膜的通透性會發(fā)生變化,，細胞膜內(nèi)側(cè)的PS部分外翻，暴露到細胞膜外側(cè),。Annexin V可通過與凋亡早期細胞胞外翻的PS結(jié)合,，從而識別凋亡細胞。為了更便于檢測,，將Annexin V標(biāo)記上熒光染料,，可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡等設(shè)備檢測到帶有熒光的凋亡細胞。細胞核染料（PI,、DAPI,、7-AAD）可與雙鏈DNA特異性結(jié)合，并產(chǎn)生強烈的熒光,。正常情況下大分子的核染料是無法透過細胞膜,，由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，細胞核染料可進入細胞內(nèi)對DNA進行染色,，與Annexin V搭配使用,，可區(qū)分處于不同凋亡時期的細胞。
檢測原理：在細胞凋亡的晚期,，染色體DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,。在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，脫氧核糖核苷酸與熒光素等標(biāo)記物形成的衍生物可以被標(biāo)記到斷裂DNA的3'-末端,，從而進行凋亡細胞的檢測,。
檢測原理：Caspase是一個蛋白酶家族，通常以無活性的酶原形式存在于細胞質(zhì)中,?；罨腃aspase會破壞一些重要的胞內(nèi)蛋白,，從而引發(fā)凋亡的發(fā)生。將Caspase序列特異性的多肽酶偶聯(lián)至黃色基團pNA作為底物,，當(dāng)Caspase被活化后,，它能夠剪切這個底物，釋放出游離的黃色基團,。通過酶標(biāo)儀或分光光度計測定這些黃色基團的吸光值,，就可以定量評估Caspase的活性，從而間接地監(jiān)測細胞凋亡的情況,。
檢測原理：在正常細胞中,，線粒體膜電位通常較高，JC-1主要在線粒體基質(zhì)中聚集,，以聚合體的形式存在,，可產(chǎn)生紅色熒光。然而,，在細胞凋亡的早期階段,，線粒體膜電位會顯著降低，導(dǎo)致JC-1無法在線粒體基質(zhì)中積累,，主要以單體形式存在,，可產(chǎn)生綠色熒光。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可檢測到細胞膜電位的下降,，可將JC-1熒光顏色的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的檢測指標(biāo),。
目前市售的凋亡檢測試劑盒種類眾多，如何選擇一款匹配自己檢測樣本和實驗條件的試劑盒至關(guān)重要,。以下是兩點可供參考的建議：
01
基于樣本類型選擇
根據(jù)具體實驗設(shè)計和樣本類型,，選擇合適的凋亡檢測試劑盒。推薦您參考下方表格所示的內(nèi)容,，以便為您的樣本類型選擇適當(dāng)?shù)牡蛲鰴z測試劑盒,。例如懸浮細胞或經(jīng)消化下來的貼壁細胞，四種凋亡試劑盒都可考慮使用,，這些試劑盒通常能夠適用于不同類型的細胞樣本,。然而，對于組織樣本,，需要注意不同的試劑盒樣本制備方法可能不同,。使用TUNEL凋亡檢測試劑盒時，需制備石蠟或冷凍切片,，而使用Caspase活性檢測試劑盒時,，則需對組織進行機械剪碎、勻漿和裂解。
02
基于實驗儀器和配置選擇
不同凋亡檢測試劑盒的使用需要配備對應(yīng)的儀器,。推薦您參考下方表格，根據(jù)實驗室現(xiàn)有的實驗儀器,，選擇合適的凋亡檢測試劑盒,。需要提醒的是，除了確認儀器是否可用,，還需要了解實驗儀器的具體配置,，例如流式細胞儀的熒光檢測通道和熒光顯微鏡的濾光片組等。
市售的Annexin V凋亡檢測試劑盒和TUNEL凋亡檢測試劑盒,，有多種熒光染料組合可供選擇,。在選擇熒光染料時，需根據(jù)儀器配置選擇能夠檢測的熒光染料,。除此之外,，如果您的細胞自帶熒光（如轉(zhuǎn)染了熒光蛋白的細胞或使用了帶熒光的藥物處理細胞），在儀器配置允許的前提下,，優(yōu)先選擇與細胞自發(fā)熒光不同檢測通道的熒光染料,。如果受限于儀器配置條件，無法避免熒光染料光譜重疊,，要注意合理設(shè)置單染管用于調(diào)節(jié)補償,，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
試劑盒種類 | 檢測樣本 | 檢測儀器 |
Annexin V凋亡檢測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 流式細胞儀,、熒光顯微鏡 |
TUNEL凋亡將測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 流式細胞儀 |
細胞爬片/涂片,、石蠟切片、冷凍切片 | 熒光顯微鏡 | |
Caspase活性檢測試劑盒 | 細胞,、組織 | 分光光度計,、酶標(biāo)儀 |
線粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒 | 懸浮/貼壁細胞 | 熒光顯微鏡、流式細胞儀 |
以上是關(guān)于凋亡檢測試劑盒的知識科普及選擇指南,，更多細胞培養(yǎng)和檢測相關(guān)干貨,，請持續(xù)關(guān)注細胞學(xué)堂專欄~
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