按照《GB 5413.20-2022 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》中LC-MS方法，對膽堿標準品進行了分析。

國標方法中使用Amide色譜柱,，本實驗使用等效HILIC型PC色譜柱（磷酸膽堿鍵合型HILIC色譜柱）進行了分析，由于CAPCELL CORE PC色譜柱保留能力更強,，考慮整體分析時間,，以及蛋白樣品可能在初始比例有機相中析出等問題，我們將初始有機相百分比降低至80%進行了分析,。

如圖1所示,，膽堿標準品保留時間為3.0 min，峰型良好,。

同時我們按照國標方法中的要求,，對膽堿系列濃度標準品（0.010 -0.200 mg/L）進行分析，得到良好線性結果,，r=0.9979,，如圖2所示。

方法檢出限為0.18 mg/100g,，滿足方法檢出限要求,。

圖1  標準品分析結果

【色譜條件】

色譜柱：CC PC S2.7; 2.1 ×100mm

流動相：A：10 mmol/L甲酸銨，甲酸調節(jié)pH為5.0

流動相：B：乙腈

流動相：B%  80%(0min) - 80%(1min) - 60%(3min) - 60%(5min) - 80%(5.1min) - 80%(8min)

流動速：0.3 mL/min

溫動度：40 ℃

檢動測：LC-MS; ESI; 104.1>60.0(CE 22 DP 80); 104.1>45.0(CE 26 DP 80)

濃動度：0.3 mg/mL

進樣量：2 µL

圖2  線性分析結果

按照國標中19.1樣品前處理方法,，對液態(tài)牛奶樣品進行了前處理,，進樣分析，得到結果如圖3所示，牛奶樣品中含有膽堿量為1.08 mg/100g,。

圖3 牛奶樣品分析結果

【色譜條件】

色譜柱：CC PC S2.7; 2.1 ×100mm

流動相：A：10 mmol/L甲酸銨,，甲酸調節(jié)pH為5.0 

流動相：B：乙腈

流動相：B%  80%(0min) - 80%(1min) - 60%(3min) - 60%(5min) - 80%(5.1min) - 80%(8min)

流動速：0.3 mL/min

溫動度：40 ℃

檢動測：LC-MS; ESI; 104.1>60.0(CE 22 DP 80); 104.1>45.0(CE 26 DP 80)

濃動度：0.3 mg/mL

進樣量：2 µL

樣品制備：稱取2.5 g試樣，用溫水溶解后,， 轉移至25 mL容量瓶中,，冷卻至室溫，用水定容混勻,。吸取1 mL樣液于50 mL比色管中,，加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL，搖晃均勻,，超聲振蕩5 min,。樣液在70 ℃水浴中加熱3 h，冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH 至5.0,， 轉移至100 mL容量瓶,，用水定容，混勻,。然后用流動相A稀釋10倍后,，經0.22 µm水性濾膜過濾至進樣瓶中，待測,。

（1）在進樣過程中發(fā)現,，由于該分析方法初始比例為高比例乙腈，高比例乙腈有可能導致樣品中剩余的少量蛋白在流動相條件中析出,，堵塞色譜柱造成柱壓升高,。可考慮在樣品配置后,，使用初始比例流動相對樣品進行最終稀釋進樣,。

（2）HILIC系色譜柱日常使用維護與反相色譜柱有較大差別，需注意HILIC色譜柱的沖洗和保存,。

綜上所述,，使用CAPCELL CORE PC S2.7; 2.1 mm i.d.×100 mm色譜柱，按照《GB 5413.20-2022 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》中第三法液相色譜-質譜串聯法,，能夠獲得良好檢測結果,，滿足標準要求。