支原體(Mycoplasma)：目前發(fā)現(xiàn)的最小原核生物，據(jù)統(tǒng)計約15~35% 的細(xì)胞被支原體污染,。支原體污染會改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能,，易致實驗結(jié)果不穩(wěn)定，須對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測,。

本試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針法) 檢測支原體DNA,。檢測對象為細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，細(xì)胞沉淀或其他生物制品,。該試劑盒具有以下特點：

靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案,，檢測靈敏度達(dá)到10CFU/ml。

       可靠：抽提加入內(nèi)標(biāo)核酸,，全過程質(zhì)量控制。

       穩(wěn)定：全程閉管操作,，無交叉污染,。

       方便：操作簡單，無需電泳步驟,。

表1   產(chǎn)品組分

注：

1,、陽性質(zhì)控含有支原體DNA和內(nèi)標(biāo)DNA。

2,、內(nèi)部質(zhì)控含有內(nèi)標(biāo)DNA,。

在實驗前請完整閱讀本說明書,，務(wù)必重視注意事項和無菌操作規(guī)范！

【操作步驟】

1.樣本制備

    （1）樣本的標(biāo)準(zhǔn)制備方案：請配合使用高效無微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA,。整個過程需要遵守?zé)o菌操作規(guī)范,。本公司目前推薦抽提試劑盒見附錄3。直接取20 µL待測樣本DNA,，作為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng),。

     （2）前處理陰性樣本準(zhǔn)備方案：將RNase Free Water當(dāng)成樣本，加入內(nèi)部質(zhì)控,，進(jìn)行核酸抽提,。

2. qPCR 反應(yīng)液的準(zhǔn)備

       （1）根據(jù)所要檢測樣品的數(shù)量，計算所需反應(yīng)孔數(shù),，每個樣本做3個重復(fù)孔,。

     反應(yīng)孔數(shù)=1個陽性PCR質(zhì)控+1個陰性PCR質(zhì)控+1個前處理陰性質(zhì)控+樣本數(shù)× 3

      （2）根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

     Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）×10 μl

      （3）各試劑放室溫融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

表2  qPCR Mix的配制

3. 加樣

      （1）震蕩混勻 qPCR Mix,，低速離心,，將管蓋殘留液體收集至管底。

      （2）向每孔反應(yīng)管中分裝 10 μL qPCR Mix,。

      （3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入15 ul石蠟油,。

      （4）向反應(yīng)管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

      表 3 加樣示例

【注】：此時每個反應(yīng)孔的體積為30μL,。

       qPCR 陰性的PCR模板為20 ul RNase Free Water,。

PCR 儀設(shè)置以 ABI 7500 為例，相對定量模式,，選擇TaqMan 探針法：

注：1,、該程序為兩階段擴(kuò)增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光,，按照正常Ct值判斷結(jié)果,；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上加15個Ct值,。

   2,、ROX設(shè)置是以7500為例，但也存在例外,，例如StepOne,。

【閾值設(shè)置】

  以ABI 7500 為例，擴(kuò)增曲線選擇 log 法,，如果不能兩階段收集熒光,，基線設(shè)置1~2個循環(huán)；如果可以，基線設(shè)置3-15個循環(huán),。建議用 log 法擴(kuò)增曲線保證結(jié)果穩(wěn)定可靠,。

（1） 內(nèi)參(HEX/VIC)閾值設(shè)定：以陽性對照定內(nèi)參擴(kuò)增曲線閾值，將內(nèi)參的Ct 值定為 28±2,。

 （2）支原體(FAM)閾值設(shè)定：以陽性對照定支原體擴(kuò)增曲線閾值,，將支原體(FAM)的 Ct 值定為 28±2 。

【實驗質(zhì)量控制】

如果陽性對照管的支原體(FAM)Ct 值>30,，但陽性對照管及前處理陰性對照管的內(nèi)參(HEX)Ct 值正常,，表明陽性支原體對照模板有降解。

如果樣品前處理陰性的內(nèi)參（HEX/VIC)Ct 值>30,，陽性對照管的內(nèi)參(HEX)Ct 值>30 ,，表明內(nèi)參DNA存在降解或PCR體系擴(kuò)增效率下降。

   【結(jié)果判讀】

根據(jù)支原體(FAM) Ct 值,、內(nèi)標(biāo)(VIC) Ct 值判定,，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：

要求每個檢測樣品做3重復(fù)，如果3復(fù)孔中,，兩重復(fù)為陽性,，則判讀為陽性；建議做樣本前處理陰性,，可以質(zhì)控整個抽提過程,。

注：檢測結(jié)果異常時：

1. 樣品前處理陰性：內(nèi)參Ct值過大，表明抽提效率低,；支原體檢測通道Ct值小于37.5,，可能前處理抽提過程存在污染。

2. qPCR陰性：支原體和內(nèi)參檢測通道Ct值小于37.5,，操作過程存在污染,。

3. 樣本前處理陰性質(zhì)控和PCR陽性質(zhì)控內(nèi)參差1±1個Ct值屬于正常現(xiàn)象,。

  【PCR過程注意事項】

由于 PCR 反應(yīng)非常靈敏,，實驗操作中應(yīng)注意以下事項，以免發(fā)生DNA 污染：

  1．試劑盒開啟后,，陽性質(zhì)控和內(nèi)部質(zhì)控與試劑Biowing® MyqPCR Reaction Mix1,、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water,、石蠟油分開存放,。

   2．每個組分在使用前都應(yīng)先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻,，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

  3．要求核酸抽提和qPCR過程都符合無菌操作規(guī)范,。

  4．建議自備轉(zhuǎn)運(yùn)盒,，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺轉(zhuǎn)運(yùn)到加樣超凈工作臺。

  5．建議在 qPCR 反應(yīng)板上陽性對照的排布應(yīng)遠(yuǎn)離待測樣本和陰性對照,。

  6．建議 qPCR 配置與分裝在一個無菌操作臺,，樣本的加樣在另外一個無菌操作臺。

  7．建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本,、陰性對照,，并使用帶濾芯的槍頭進(jìn)行加樣。

  8．應(yīng)按照先加陰性,，再加樣本,，最后加陽性的順序加樣。且陽性用專門的加樣器,。建議陽性在專門的無菌操作臺加樣,。

  9．qPCR 反應(yīng)板封膜或蓋蓋子時須反復(fù)壓緊。

 10．上機(jī)擴(kuò)增前,，反應(yīng)管短時低速離心,，將管壁液體收集至管底

 11．蓋上反應(yīng)管蓋子或者貼上光學(xué)膜后，為避免影響熒光信號讀取,，請注意不要在管蓋或者膜上做標(biāo)記,，或者用刮板反復(fù)摩擦。

 12．本產(chǎn)品僅作科研用途,。