ELISA實驗步驟

 圖3 ELISA標準實驗流程

實驗前準備：
1.   樣本采集：
a)   血漿：采集血漿時可使用EDTA,、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑。采集后30分鐘內,，1000xg離心15分鐘,。立即檢測或分裝后于≤-20℃儲存。避免反復凍融,。
b)   細胞培養(yǎng)上清液：通過離心去除顆粒,，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存。避免反復凍融,。
c)   細胞裂解液：在裂解緩沖液中裂解細胞并將其放在冰上靜置30分鐘,。14,000xg離心5分鐘除去不溶物。將上清液轉移至新管中利用總蛋白分析法定量總蛋白濃度,。立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存,。
d)   乏血小板血漿：在采集血漿時可使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝血劑,。采集后30分鐘內,，1000xg離心15分鐘。建議在2-8°C下,，10,000xg 再次離心10分鐘,，以便全去除血小板。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存,。避免反復凍融,。
e)   血清：使用不含抗凝劑的收集管,，讓樣品在室溫下凝結30分鐘，然后1000xg離心15分鐘,。立即取出血清并進行檢測或分裝后于≤-20°C儲存,。避免反復凍融。
f)   唾液：將唾液收集到管中,，10,00xg離心5分鐘,。收集水相，立即檢測或分裝后將樣品于≤-20°C儲存,。避免反復凍融,。
g)   尿液：無菌進行當天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入無菌容器中,。離心去除不溶顆粒物質,。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。避免反復凍融,。
h)   母乳：2-8°C,，1000xg 離心15分鐘。重復進行水相部分的收集,，總共3次,。立即檢測。
i)   組織勻漿液：制備方法因組織類型而異,。用1XPBS緩沖液沖洗以除去多余血液,，使用20mL 1XPBS進行勻漿，并于≤-20°C下儲存過夜,。將勻漿液凍融兩次以便破壞細胞膜,，然后5000xg離心5分鐘。去除上清液后立即進行檢測,，或者分裝后于≤-20°C儲存,。避免反復凍融。
j)   組織裂解液：用PBS沖洗組織,，將組織切成1-2mm的薄片,，用組織勻漿器在PBS中進行勻漿。加入等體積的含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液,，在室溫下裂解組織30分鐘,，裂解過程中輕搖裂解液。離心去除沉淀,。利用總蛋白質分析法定量總蛋白的濃度,。立即檢測或分裝后于≤-20°C儲存。
2. 預實驗
ELISA實驗中進行預實驗是非常有必要的,，一方面為了檢測試劑盒是否好用,，標曲擬合線性是否良好,，最高OD值是否能達到2.0左右，是否存在假陽性假陰性,；另外一方面為了檢測樣本最佳稀釋比例,，樣本濃度過高要進行稀釋；樣本濃度過低要選擇超敏試劑盒,。
3. ELISA實驗對照
a)   空白對照：提供背景信號參考,，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度。
b)   陽性對照：已知含有目標蛋白的內源性可溶樣品,，或已知含有檢測抗體免疫原的純化蛋白或多肽來作為陽性對照,。當樣品的檢測結果為陰性時，陽性對照的陽性結果可表明實驗過程無誤且有效,，所以實驗的陰性結果是真實的,。
c)   陰性對照：已知不表達目標蛋白的樣品。其有助于檢測非特異性結合和假陽性結果,。
d)   標準品：含有已知濃度的目標蛋白的樣品,，可從中獲得標準曲線。
e)   樣本基質中的標準品（加標對照品）：加標對照可用來給出有關某種特殊樣品基質中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息,，從而表明檢測性能,。比如，在 ELISA 中檢測血清樣品時,，按照慣例標準品用正常稀釋緩沖液來稀釋。但可以同時用檢測的種屬血清來稀釋標準品,。
4.實驗步驟（以Human IL-6 ELISA Kit – Quantikine,，Catalog # D6050）
1. 使用前將所有試劑和樣品置于室溫。建議所有標準品,、對照品和樣品一式兩份,；
2.用不完的微孔板條可以移除，將它們放回含有干燥劑包裝的箔袋中,，并重新密封,；
3. 每孔加入100 μL檢測稀釋劑RD1W；
4. 每孔加入100 μL標準品,、對照品或樣品,，蓋上蓋子。室溫孵育2小時,。同時做好板布局的記錄,；
5. 棄去液體，使用400 μL洗滌緩沖液洗滌,，重復三次,，共洗滌四次,。有條件的話可以使用自動洗板機，最后一次洗滌的時候,，去除掉所有洗滌緩沖液后,，把孔板倒置，用干凈的吸水紙吸干,；
6. 每孔加人IL-6檢測抗體200 μL,。蓋上蓋子，室溫孵育2小時,；
7. 重復步驟5中的洗滌,；
8. 每孔加底物溶液200 μL，室溫下孵育20分鐘,，避光,；
9. 每孔加入50 μL反應停止液。并且能夠觀察到孔里的顏色從藍色變成黃色,。如果孔內顏色呈綠色或顏色變化不均勻,，輕拍板以確保充分混合；
10. 在30分鐘內測定每個孔的吸光度,，設置酶標儀波長為450nm,。如果有波長校正，請設置為540nm或570nm,。如果波長校正不可用,，可以用450nm讀數(shù)減去540nm或570nm讀數(shù)。

ELISA操作小技巧
 

圖4 ELISA操作小技巧（圖源于R&D）

ELISA常見問題

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參考資料：Bio-techne ELISA技術指南