如何提高超薄切片機(jī)的切片質(zhì)量并實現(xiàn)自動對齊功能

超薄切片技術(shù)是獲取樣品切片的常用方法。在室溫條件制備時,，將樣品小塊嵌入環(huán)氧樹脂中,，然后通過修剪去除多余的樹脂，并使用玻璃刀或金剛石刀將樣品切成厚度為50-100納米之間的薄片,。

切片過程涉及多個手動制備步驟,。在本應(yīng)用說明中，我們將概述該過程,，并解釋新的自動化解決方案,，如何消除復(fù)雜的手動設(shè)置需求。

簡 介

透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）等電子顯微鏡技術(shù),，廣泛應(yīng)用于獲取生物或非生物材料樣品的結(jié)構(gòu)信息,。在電子顯微鏡（EM）應(yīng)用中，較厚的樣品被切割成厚度

小于100納米的超薄切片,。

該樣品制備方法有助于獲取高分辨率的電子顯微鏡圖像,，并且能夠進(jìn)一步通過計算重建從多個連續(xù)切片中收集的信息，從而獲得較厚樣品的概覽（體積電子顯微鏡學(xué)）,。

樣品塊的修整

為了獲得具有特定厚度的均勻切片,，必須執(zhí)行多個手動步驟，并具備相應(yīng)的技能和專業(yè)知識,。

粗 修

在切割感興趣區(qū)域之前,，必須對樣品進(jìn)行初步修整,，以露出目標(biāo)點，并去除過量的無樣品聚合物或非目標(biāo)樣品區(qū)域,。通常,，修整的結(jié)果是形成（堆疊的）金字塔形狀，其尺寸逐漸減?。▓D1）,。

圖1：經(jīng)過粗修和精修后的樣品塊。放大圖顯示了聚合物塊前端上的樣品面,。聚合物塊前端面使用銑削裝置,，以45°的形狀進(jìn)行修整。使用超薄 切片機(jī)和具有45°邊緣的切片刀對塊面進(jìn)行修整,，

形成金字塔形狀,。

首先，粗修是通過手動使用刀片或使用EM RAPID來制備金字塔截體,。EM RAPID的高速金剛石銑削頭,，可以以特定角度朝向樣品，同時樣品在四輪中能夠進(jìn)行90°旋轉(zhuǎn)（圖2）,。

圖2：使用EM RAPID銑削裝置對樣品塊進(jìn)行粗修,。左：修整前的樣品塊。中：銑削第二個區(qū)域,。右：最終粗修后的樣品,。

精 修

接下來，將樣品塊安裝在超薄切片機(jī)上,，并使用修塊刀減小樣品區(qū)域并塑造其形狀,，以形成最終的切面。精修的目的是將樣品感興趣區(qū)域包含在小于1平方毫米的矩形或梯形區(qū)域內(nèi),，

并使上下邊緣與切片刀平行（圖3）,，這將在后續(xù)步驟中允許切片彼此粘附形成帶狀。帶狀切片可以整體收集,，使用戶能夠按照切片的順序進(jìn)行拍攝,，這對于陣列斷層掃描應(yīng)用尤其重要。

圖3：使用金剛石修塊刀進(jìn)行精修,。

左：粗修后的樣品塊,。中：精修前樣品塊的前端。下方可見一把45°金剛石修塊刀,。右：樣品塊面的前端和右側(cè)已經(jīng)進(jìn)行了精修,。

樣品與切片刀之間對齊

在對樣品塊進(jìn)行修整以獲得平坦且暴露的塊面后，將其正確對齊到切片刀邊緣至關(guān)重要。最終目標(biāo)是使樣品與切割平面之間的距離盡可能小,，以避免樣品材料損失和切片不完整,。

對齊樣品和切片刀是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。它需要精密地手動調(diào)整樣品傾斜,、旋轉(zhuǎn)和切片刀角度，同時需要正確地控制樣品進(jìn)給（進(jìn)刀）,。

這對于新手或不常使用超薄切片機(jī)的用戶來說尤其困難,。不僅存在損壞昂貴切片刀的風(fēng)險，而且還可能損壞樣品,，無法用于切片,。即使經(jīng)驗豐富的操作人員也需要小心謹(jǐn)慎，

以確保在較薄樣品（如細(xì)胞單層）切片過程中,，不會因初始位置未對齊,，而損失太多材料。

方 法

為了判斷切片刀與樣品之間的距離,，用戶需要使用底照光來觀察它們之間的間隙,，整個過程在體視顯微鏡下進(jìn)行。底照光從下方照亮切片刀的背面,，并通過樣品塊面的光滑表面反射光線,，呈現(xiàn)為一條明亮的條紋（圖4）。這被稱為“光隙”,。

對齊表現(xiàn)為在整個塊面長度上均勻?qū)挾鹊谋,。ㄋ{(lán)色）光隙（見下文）。

圖4：切片刀背面在樣品塊面上的反射圖像,。

左：概覽圖,，底照光被切片刀的背面反射至樣品塊面，幾乎照亮了整個前端面,。右：用切片刀接近樣品時,，塊面上的反射光變成小條紋，稱為光隙光隙是指示切片刀與塊面之間方向的工具,。

以下步驟通常以迭代順序執(zhí)行,，直到塊面和切片刀對齊為止。通常,，兩者之間的距離可以小于500納米,。

樣品旋轉(zhuǎn)

為確保切片能夠彼此粘附并形成帶狀，切片的上下邊緣必須平行,。這只有在整個塊面與切片刀接觸時才能實現(xiàn),。因此，必須旋轉(zhuǎn)樣品以使其與切片刀邊緣平行（圖5）。

圖5：調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn),。左：樣品旋轉(zhuǎn)與切片刀邊緣的示意圖,。中：樣品未正確旋轉(zhuǎn)。右：樣品正確對齊到切片刀,。

首先,，將切片刀座移至足夠接近樣品的位置，以產(chǎn)生光隙,。一旦在塊面上觀察到光隙,，用戶需要調(diào)整樣品旋轉(zhuǎn)，使塊面下邊緣與切片刀平行,。如果未調(diào)整切片刀角度,，可能無法使樣品和切片刀平行，因為塊面尚未被修塊刀修整,。

切片刀角度

為了補(bǔ)償塊面表面與切片刀之間的角度,，需要旋轉(zhuǎn)切片刀，直到塊面的前導(dǎo)邊緣與切片刀平行（圖6）,。這將確保樣品從左到右的整個區(qū)域與切片刀接觸,，從而提供完整的切片，不會損失太多樣品材料,。此外,，上述操作確保樣品切割均勻，并使切片能夠彼此粘附,，在切片刀水槽中形成條帶（圖6,，下圖）。

圖6：調(diào)整切片刀角度,。左上：切片刀和樣品塊面的示意圖,。藍(lán)色切片刀以其邊緣與塊面平行的方式轉(zhuǎn)動。中上圖像：底照光照亮的塊面圖像,。切片刀邊緣在圖像底部可見為黑色條紋,。

切片刀邊緣必須與塊面的下邊緣平行，但在這里并非如此,。右上圖像：調(diào)整切片刀角度,，使其與塊面邊緣平行。下圖像：切片在切片刀水槽中形成條帶,。切片具有平行的邊緣,，因此彼此粘附。

樣品傾轉(zhuǎn)

樣品傾轉(zhuǎn)是最關(guān)鍵但不易觀察的影響參數(shù)之一,。如果樣品傾轉(zhuǎn)不正確,，切片刀在切割過程中將不會與樣品運(yùn)動保持一致,。因此，在獲得完整切片之前,，可能會丟失珍貴的樣品,。

通過弧形樣品夾以調(diào)整塊面與切片刀邊緣之間的角度，可以調(diào)節(jié)樣品傾轉(zhuǎn),。以光隙為指標(biāo),，用戶在調(diào)整過程中需要上下移動樣品，直到光隙在整個塊面上顯示相同的厚度（圖7）,。

這需要通過迭代方法來調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn),。在這個階段，切勿將切片刀太靠近樣品,，否則塊面的離切片刀較近部分可能會被切掉，從而有損失整個樣品的風(fēng)險,。同時,，也存在切片刀損壞的風(fēng)險。

圖7：調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn),。左：樣品傾轉(zhuǎn)原理的示意圖,。樣品傾轉(zhuǎn)，直到塊面表面沿切割運(yùn)動方向與切片刀邊緣對齊,。

中：上下移動樣品時的兩個光隙圖像,。灰色條紋的厚度不同,。右：調(diào)整后的光隙,。

以光隙為作為調(diào)整的指標(biāo)

樣品和切片刀角度調(diào)整的最后一步是使用光隙作為指標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。在調(diào)整樣品傾轉(zhuǎn)之后,，小心地將切片刀朝樣品推進(jìn),，直到切片刀與塊面之間的光隙幾乎看不見。在接近過程中,，光隙的顏色會發(fā)生變化,，

直到最終變?yōu)樗{(lán)色（顏色的變化是衍射的結(jié)果，圖8）,。使用這種方法,，在整個塊面上對齊偏差能夠小于1µm。從塊面反射出的藍(lán)色光隙,，通常表示塊面與切片刀之間的距離約為400納米,。在此距離下，

在所有角度上均勻分布的光隙是準(zhǔn)確指標(biāo),，盡可能減小材料的損失,。

圖8：精細(xì)調(diào)整過程中,，切片刀與塊面之間衍射產(chǎn)生的藍(lán)色光隙。

圖9：帶有電動切片刀架（1）和弧形樣品夾（2）的UC Enuity

內(nèi)置的flexacam（i5或c5）相機(jī),，提供了切片刀和光隙的圖像,，這些圖像會被分析，并將信息發(fā)送回來,，以進(jìn)行自動對齊工作（圖10）,。

圖10：內(nèi)置flexacam i5相機(jī)和觸摸屏截圖，顯示帶有自動對齊反饋線的圖像（也見下文）,。

對齊過程會引導(dǎo)用戶完成接近階段,，最終對齊步驟將自動完成。這種自動化設(shè)計旨在保護(hù)切片刀和塊面免受損壞,，同時幫助用戶實現(xiàn)對齊,。該功能幫助未經(jīng)過培訓(xùn)的用戶，

如在核心設(shè)施或研究組內(nèi)工作的用戶,，在切片刀和樣品的初始定位階段,，在不承擔(dān)損壞風(fēng)險的情況下獲得高質(zhì)量切片。

需要注意的是,，要執(zhí)行自動對齊功能,，必須滿足某些先決條件。例如,，塊面尺寸必須至少為250 x 250µm,，最大為1200 x 1200µm。此外,，塊面必須具有反射性且足夠干凈,。

自動化工作流程

開始自動對齊程序前，首先應(yīng)將切片刀接近塊面并居中,。在用戶確認(rèn)后,，將執(zhí)行自動對齊功能（圖11）。

圖11：UC Enuity顯示屏截圖,，顯示檢測光隙步驟中的相關(guān)交互按鈕（左）,。自動對齊過程中的相機(jī)圖像（右）。反饋線指示圖像中是否檢測到正確的邊緣,。

綠色：垂直中心線,；洋紅色：光隙的上邊緣；白色：光隙的下邊緣（此處不可見,，與紅線重合）,；紅色：切片刀邊緣；藍(lán)色：自動檢測到的塊面左邊緣和右邊緣,。

軟件檢測圖像中的不同邊緣,，并對切片刀角度,、樣品傾斜和樣品旋轉(zhuǎn)進(jìn)行迭代對齊。在此過程中,，樣品會上下?lián)u動,，以觀察分析整個塊面范圍的光隙，并據(jù)此調(diào)整樣品傾斜,。

在過程結(jié)束時,，可以自動將切片刀接近樣品，直到大約5µm的距離（圖12）,。如果需要,，也可以進(jìn)行手動校正。

圖12：切片刀接近樣品,，安全距離約為5µm,。左：對齊后，用戶可以決定自動或手動接近樣品,。右：接近后的光隙,。將保持約5µm的安全距離。

多組測試結(jié)果

對齊過程的目的是避免在獲得完整切片之前,，不必要地?fù)p失部分樣品區(qū)域,。為了提供確鑿的證據(jù),，證明自動對齊功能能夠可靠地產(chǎn)生高質(zhì)量切片,，我們對樣品進(jìn)行了一系列超薄切片測試。

在第一組代表性樣品中,，專家手動進(jìn)行了對齊,。通常，專家需要切割5-10個厚度為100nm的部分切片,，直到獲得完整切片,。另一組樣品使用UC Enuity的自動對齊功能進(jìn)行修塊，其中五個不同樣品使用不同設(shè)備進(jìn)行修塊,，樣品塊面尺寸不同,。在兩組測試中，部分切片的平均數(shù)量均低于或等于10,，而最少部分切片的數(shù)量在3到7之間（表2）,。這證明使用UC Enuity可以成功實現(xiàn)自動對齊。

表2：使用UC Enuity自動對齊后獲得完整切片所需的部分切片數(shù)量,。

測試1,，n=4；測試2,，n=2,；測試3,，n=4；測試4,，n=7,；測試5，n=2,。

總 結(jié)

在超薄切片中,，切片刀和樣品的對齊，對于實現(xiàn)高質(zhì)量切片和減少獲得完整切片前的樣品材料損失至關(guān)重要,。

由于對齊過程較為復(fù)雜,，手動操作時需要用戶具備豐富經(jīng)驗，因此UC Enuity提供的自動對齊解決方案,，有助于減少非熟練和不常用戶對樣品或切片刀造成損壞的風(fēng)險,。

UC Enuity還幫助他們實現(xiàn)的光隙調(diào)整，為高質(zhì)量的切片提供了基礎(chǔ),。