細胞凋亡與壞死是兩種不同的細胞凋亡形式,，根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別,，可以將二者區(qū)別開來,。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法,。

一,、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

　　根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法,。
　　1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
　?。?/span>1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形,，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現(xiàn)皺縮,、變圓,、脫落。
　?。?/span>2） 染色細胞：常用姬姆薩染色,、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮,、邊緣化,，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
　　2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
　　一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細胞凋亡的進展情況,。
　　常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342),，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與　DNA的結(jié)合是非嵌入式的,，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū),。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。
　　Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料,，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
　　DAPI為半通透性,，用于常規(guī)固定細胞的染色,。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml,。
　　結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）,，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚,、邊緣化,；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體,。

3 透射電子顯微鏡觀察
　　結(jié)果評判：凋亡細胞體積變小,，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞,，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu),；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化,；細胞凋亡的晚期,，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體,。

二,、二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

　　磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè),，但在細胞凋亡的早期,，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中,。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC,、PE）或biotin標(biāo)記,，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針,，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生,。
　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,，它不能透過完整的細胞膜,，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染,。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來,。

方法
　　1 懸浮細胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次,，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min,，再加入PI（50ug/ml）5ul,，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Binding Buffer,，立即用FACScan進行流式細胞術(shù)定量檢測（一般不超過1h）,， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
　　2 貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化,，洗滌,、染色和分析同懸浮細胞。
　　3 爬片細胞染色：同上,，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察,。

三、線粒體膜勢能的檢測

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細胞發(fā)生凋亡,，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件,，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮,、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰,，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn),。
　　線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123,、3,，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1],、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì),，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。
　　方法：將正常培養(yǎng)的細胞和誘導(dǎo)凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM）,，JC-1（1mM）,，TMRM（100nM）,，37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度,。
　　注意事項
　　1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性,，因為pH值的變化將影響膜電位。
　　2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白,，他們將與部分染料結(jié)合,，降低染料的濃度，引起假去極化,。

四,、DNA片斷化檢測

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經(jīng)處理后,，采用常規(guī)方法分離提純DNA,，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder,。如果細胞量很少,，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記,，然后進行電泳和放射自顯影,，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
　　1. 大分子染色體DNA片段的測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段,。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同,。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限,。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA,，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠,，這種遷移模式稱之為"爬行",。因此，細胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離,。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題,。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后,，大的DNA分子便滯流在爬行管中,，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動,。DNA分子量越大,，這種重排所需要的時間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時,，DNA就可以按其分子量大小分開,。
　　參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
　　2． DNA Ladder 測定
　　方法：收獲細胞（1X107）沉淀?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C,，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA,，4°C過夜?14000rpm′15min?最后將沉淀溶解在TE buffer中,，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相,。

五,、TUNEL法

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下,，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）,。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色,。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,，可用于石蠟包埋組織切片,、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定,，并可檢測出極少量的凋亡細胞,，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

六,、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能,。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中,，在凋亡的早期階段，它被激活,，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成,，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡,。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞,，caspase-3的活性明顯下降。
　　1 Western blot 分析Procaspase-3的活化,，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,，PARP]等的裂解,。
　　方法：
　　收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次,，5~10min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2h→ TBS-T洗3次,， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。

2 熒光分光光度計分析
　　原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物,，水解D4-X肽鍵,。根據(jù)這一特點，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC,。在共價偶聯(lián)時,，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC,，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光,。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性,，從而反映Caspase-3被活化的程度,。
　　方法：收獲細胞正常或凋亡細胞,，PBS洗滌,，制備細胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應(yīng)1h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發(fā)光波長380nm,，發(fā)射光波長為430-460nm）,。

3 流式細胞術(shù)分析
　　方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌,，加Ac-DEVD-AMC 37°C反應(yīng)1h UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度,。