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豬胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
豬胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定豬血清,，血漿及相關(guān)液體樣本中胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）含量,。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用夾心法測(cè)定標(biāo)本中胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）水平,。用純化的豬胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）受體包被微孔板，往微孔中依次加入胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）,，再與HRP標(biāo)記的羊抗豬抗體結(jié)合,，形成免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）濃度。
試劑盒組成：
| 試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
| 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | |
| 封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
| 密封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | |
| 酶標(biāo)包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品：270μg/L | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 | 1.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 酶標(biāo)試劑 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,，在*,、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻,；然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五、第六孔中,，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,，混勻,；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻后從第七,、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為180μg/L,，120μg/L ,，60μg/L,，30μg/L，15μg/L）,。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3,。
8. 洗滌：操作同5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行,。
注意事項(xiàng)：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2． 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
6． 底物請(qǐng)避光保存,。
7． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8． 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9． 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異,，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo),，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值
代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋
倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上,。
2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和15%
檢測(cè)范圍：
10μg/L -200μg/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：,；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月
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