懸浮細胞的電融合轉(zhuǎn)染技術(shù)
融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進行高強度的電場脈沖前后,，必須用低幅,、高頻電場使細胞排成一條鏈。
1 用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細胞兩次,，然后懸于FM中,。洗滌細胞時，在臺式離心機上1000rpm下離心3分鐘,，得到細胞沉淀,，棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。
2 將懸浮細胞轉(zhuǎn)移到相應的融合室內(nèi),。假如要使兩種不同的細胞彼此融合,，轉(zhuǎn)移前要充分混合。
3 啟動介電電泳場,，其振幅通常小于200V/cm,，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測細胞是否排成一條鏈,，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達到最佳效果,。
4 讓介電電泳場開約1分鐘后關掉，立即應用融合脈沖,，其振幅數(shù)量級為1kV/cm,。脈沖寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場,，常規(guī)讓其開啟約2分鐘,。
5 關掉介電電泳場，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘,。
6 去掉FM,，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細胞。
7 將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿,，加入普通培養(yǎng)基,，在培養(yǎng)箱一般條件下培養(yǎng)。

[注意事項]
1 適宜組分依使用的特定細胞種類而有變化,。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意,，就應嘗試改變穿孔介質(zhì)。
2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態(tài)有關,，為達到高效率,，必須收集對數(shù)生長中期的細胞,。
1.純化siRNA
在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA,，推薦用玻璃纖維結(jié)合,，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸,，蛋白和鹽離子,。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗,。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在,，如皮膚，頭發(fā),，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等,，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性
通常,，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高,。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性,。為了優(yōu)化實驗,，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降,。
4.避免使用抗生素
抗生素會在穿透的細胞中積累毒素,。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下,，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗,，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。
5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑
針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同,，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關重要,。
 6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件
對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照,。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA）,，轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡,。
7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗
熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率,。標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來,。

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