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在4月17日普諾賽直播間中,，徐老師從誘導分化步驟,、細胞狀態(tài)及密度、試劑配置及保存,、誘導結果展示4個方面為大家詳細介紹了間充質(zhì)干細胞成脂,、成骨、成軟骨誘導分化,。直播回放請點擊微信公眾號菜單欄【資料中心】-【往期直播回放】查看,，或在B站搜索“普諾賽生物”，點擊最新視頻觀看學習,。
本期直播答疑,，我們從直播間幾十個提問中，篩選出部分代表性問題,，并做了詳細解答,。若有其他問題，歡迎大家在推文底部留言,，或點擊微信公眾號菜單欄【快速查詢】-【在線咨詢】,，我們將在線解答。
1
成脂誘導前不需要接觸抑制2天嗎,？有的文獻說必須要接觸抑制細胞才能分化,。
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可根據(jù)當前的細胞狀態(tài)以及使用的誘導試劑來決定是否接觸抑制；
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使用普諾賽的成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導細胞時,，不需要接觸抑制2天,。在細胞接種后，密度達到95%-100%時,，即可開始誘導,；
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誘導期間細胞是在緩慢增殖和誘導分化的。在這個過程中,，細胞會逐漸退出生長期,，同時也保證了細胞處于最佳狀態(tài)開始分化,。
2
2.油紅O染色液過濾用什么濾紙？
使用0.22 μm或0.45 μm的尼龍材質(zhì)濾膜或中性濾紙進行過濾,，去除油紅O染色液中的雜質(zhì),。
3
AB液培養(yǎng)交替時，需要用PBS充分洗滌嗎,？推薦的洗滌次數(shù)是,？
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在成脂誘導過程中，A液和B液交替換液,；
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換液時,，可以用PBS洗滌細胞1次，但需要注意操作時清洗細胞的次數(shù)越多,，越容易造成細胞卷邊漂?。?/p>
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若操作熟練且細胞狀態(tài)較好,，可以盡可能的吸去A液,，然后再沿著孔壁緩慢加入預熱好的新鮮B液，反之亦然,；若操作不熟練，可嚴格按照以下操作：用PBS 清洗細胞1次,，換液時可先吸出大部分培養(yǎng)基或PBS緩沖液丟棄,，留少量原液在孔板內(nèi)作為緩沖，接著沿孔壁緩慢加入要更換的預熱新鮮培養(yǎng)基,。
4
3T3細胞可以用于成脂誘導嗎,？誘導流程是和間充質(zhì)干細胞成脂誘導的一樣嗎？MC3T3-E1細胞也是按照間充質(zhì)干細胞成骨誘導步驟進行誘導嗎,？
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3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細胞)細胞可進行成脂誘導實驗,，普諾賽也有配套的成脂誘導分化培養(yǎng)基（貨號：PD-031），具體步驟可以參考配套誘導分化試劑的說明書,；
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MC3T3-E1 Subclone 14 (小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14)細胞可用于成骨誘導實驗,，普諾賽也有配套的成骨誘導分化培養(yǎng)基（貨號：PD-033），具體步驟可以參考配套誘導分化試劑的說明書,。
5
在誘導過程中拍照要打開蓋子嗎,？如何通過觀察細胞，后續(xù)進行誘導條件調(diào)整,？
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如果是在誘導過程中拍照觀察細胞狀態(tài),，請不要打開蓋子，防止細胞污染,，影響后續(xù)細胞的狀態(tài),；
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誘導過程中可通過鏡下觀察細胞狀態(tài),，比如細胞是否出現(xiàn)卷邊漂浮、碎裂,、污染等情況來判斷誘導過程是否順利,；
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若誘導過程中，細胞出現(xiàn)輕微卷邊現(xiàn)象,，在換液過程中要更加輕柔,，可留少量原液作為緩沖，培養(yǎng)基37℃復溫后再使用,；或者使用包被過的孔板進行誘導,，增強細胞的吸附性，減少卷邊漂浮的情況,；
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若發(fā)現(xiàn)污染情況,，請立即排查試劑、耗材等污染源,，小心處理已經(jīng)污染的板子,，防止污染其他孔板；
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實驗開始時,，建議多做幾個單獨孔板的重復組,。在誘導后期，可通過鏡下觀察和染色來判斷誘導實驗是否成功,。
6
舊包裝誘導劑的哪些成分需要-20℃保存,？也是不能反復凍融的嗎？
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舊包裝的誘導試劑保存條件可參照說明書和試劑管上標簽備注的保存條件進行保存,；
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舊包裝的成骨誘導試劑中：FBS,、谷氨酰胺、青鏈霉素,、β-甘油磷酸鈉,、抗壞血酸和地塞米松B均需要-20℃保存；不建議反復凍融,，若一次用不完可分裝后凍存,；
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舊包裝的成脂誘導試劑中：FBS、谷氨酰胺,、青鏈霉素,、胰島素、IBMX,、羅格列酮和地塞米松A均需要-20℃保存,；不建議反復凍融，若一次用不完可分裝后凍存,；
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舊包裝的成軟骨誘導試劑中：丙酮酸鈉,、ITS添加物,、TGF-β3、抗壞血酸,、脯氨酸,、地塞米松B和青鏈霉素均需要-20℃保存；不建議反復凍融,，若一次用不完可分裝后凍存,。
7
成骨的各種試劑也需要預熱嗎？
成骨誘導分化培養(yǎng)基配置完成后,，使用前需37℃復溫半小時以上,，手感溫熱即可使用。預熱的主要目的是為了避免過大溫差對細胞造成刺激,，導致細胞收縮,、卷邊甚至脫壁，影響后續(xù)實驗結果,。
8
成骨誘導培養(yǎng)基自己配制好配嗎,？
如果購買的是普諾賽配套的成骨誘導分化培養(yǎng)基，可按照說明書的配比添加相應成分配置即可,，配置簡單,。如果是參考文獻中的配方自己配置誘導試劑，這個誘導效果就不好評估了,，建議配置后先進行預實驗檢測下誘導效果,。
9
為什么要包被呢？細胞誘導久了容易聚集怎么解決呢,？
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包被是為了增強器皿的吸附性,，從而使細胞能夠更好地展開,，貼壁更牢,，有效預防在誘導過程中細胞出現(xiàn)卷邊或漂浮的情況；
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若細胞誘導時間長了,，出現(xiàn)聚集的情況,，老師在進行實驗時可注意提前包被孔板、控制初始細胞接入量,、細胞鋪板均勻,、換液輕柔、培養(yǎng)基復溫等細節(jié),，盡量減少對細胞的刺激,。
10
拍照有什么注意事項嗎？
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在誘導過程中拍照時,，請確保調(diào)整好焦距,，并選擇合適的位置來拍攝不同倍鏡下的細胞圖片,；
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染色后拍照時，請注意不同顯微鏡可能拍出略有差異的顏色,。因此,，需要仔細觀察鏡下顏色，確定拍出的染色圖沒問題,。同時清洗完染液后,，可留適量的PBS，以減少光圈的出現(xiàn),，從而呈現(xiàn)出更好的效果圖,。
11
成軟骨誘導完成后，進行包埋切片,，切片是切多少微米的呢?我的球每次培養(yǎng)都很小,，直徑都沒有1mm不知道是不是正常的，切片也只能切兩三片,，掃描也看不清楚,，是為什么呢？
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軟骨球切片厚度為3~5 μm,，誘導結束后的軟骨球直徑大概在1~2 mm左右,；
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開始誘導的細胞量需要嚴格控制在2.5~3*105 cells/0.5 mL/管；
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細胞量太多的話,，球過大,，誘導過程中可能會導致一些細胞死亡，球破裂,；細胞量太少的話可能難以形成球,，即便形成了較小的軟骨球，后續(xù)操作也不好進行,；
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培養(yǎng)的球直徑比較小,，可能原因是初始細胞量較少、誘導時間短,、沒有誘導成功等,。切片厚度可以控制在4 μm，切片正常的話,，肉眼可觀察到有一個很小的軟骨球片,，呈小圓餅狀，染色后肉眼可見更加明顯,。
12
這三個誘導,，原代細胞都要用3代以內(nèi)細胞么？
原代細胞是組織現(xiàn)提取分離的,，體外培養(yǎng)代次有限,，且隨著細胞代次的增加,，細胞的增殖速度以及狀態(tài)也會慢慢變差。建議使用三代以內(nèi)的細胞開始誘導,，在細胞狀態(tài)最佳的時候進行實驗,，做出來的結果也會相對更好。
13
人細胞的成軟骨分化試劑盒可以用于小鼠的細胞嗎,？
建議使用對應種屬的成軟骨誘導分化培養(yǎng)基,，效果最-佳。但也有相關資料顯示,，成軟骨誘導分化培養(yǎng)基對種屬的要求沒有那么嚴格,，一般人的成軟骨誘導分化培養(yǎng)基也可以用于小鼠。然而誘導過程中的影響因素較多,，如果混用的話,，建議先做預實驗進行摸索。
14
成軟骨的鑒定,，除了染色,，有沒有什么特異的靶標？
軟骨結構復雜,，主要是由一些基質(zhì)成分組成,，包括II 型、IX 型,、X I型膠原和一些蛋白多聚糖,，其中以II型膠原（Collagen II）和糖胺聚糖為主。成軟骨誘導過程中會生成蛋白多聚糖和Collagen II等細胞外基質(zhì),，可通過免疫熒光染色,、甲苯胺藍/阿利辛藍染色、qRT-PCR 檢測成軟骨特異指標Ⅱ型膠原,、蛋白多糖和成軟骨轉錄因子 SOX9 的基因表達及蛋白合成情況,，具體可參考文獻。
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