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蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工，做信號通路必然是要檢測蛋白磷酸化的,，Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法,，其實和跑正常蛋白沒什么出入,，只不過孵育的是識別磷酸化的抗體,。下面恒遠(yuǎn)生物帶大家總結(jié)一下實驗中的注意要點,。
一,、關(guān)于磷酸化蛋白樣品
裂解液問題蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應(yīng),，取樣品的過程要迅速,，樣品要新鮮，樣品處理最好在冰上操作,，操作時間盡量短,。用PBS洗滌細(xì)胞時，PBS一定要4℃預(yù)冷,。如果是組織的話,，提取蛋白時采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前預(yù)冷,，保持低溫的狀態(tài),。
提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,，否則即使條帶壓出來也會很淺,，結(jié)果也不可信。okadaic acid,，NaF是磷酸酶抑制劑,。再者，還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸,。
二,、關(guān)于WB時背景和條帶的問題
磷酸化蛋白WB時背景也往往較深，所以壓片時間要適當(dāng),，不能太長或過短，太長則背景太深蓋住想要的那條帶,，時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺,。做磷酸化蛋白WB時，除了目標(biāo)蛋白的條帶以外,，往往會出現(xiàn)非特異性的條帶,。磷酸化抗體不好的話，甚至?xí)撼龇翘禺愋缘臈l帶,，反而沒有你想要的條帶,，所以壓片后,，一定要根據(jù)Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
三,、關(guān)于蛋白總的表達(dá)量問題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量,。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上,，也可在不同的膠上）,，其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白）,，甚至還可跑另一個膠,，壓內(nèi)標(biāo)。但是一般不建議如此做,，因為這樣比較時誤差還是較大的,。因此，比較常用的方法,，即用strip液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去,，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次,，再壓內(nèi)標(biāo),。
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