單克隆抗體制備的原理：

B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下,能夠分化,、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力,、B細(xì)胞的這種能力和量是有限的,不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的,、將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞,，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長的能力,，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力,，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體.這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。

單克隆抗體制備的過程：

免疫動(dòng)物

免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠,，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過程,。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射,。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官,，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化,、增殖,，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。

細(xì)胞融合

采用二氧化碳?xì)怏w處死小鼠,，無菌操作取出脾臟,，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液,。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合,，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合,，形成雜交瘤細(xì)胞。

選擇性培養(yǎng)

選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞,，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基,。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡,。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡,。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖,。

雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞,，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此,，必須進(jìn)行篩選和克隆化,。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏,、快速,、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞,，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增,。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型,、亞類、特異性,、親和力,、識別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存,。

單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法,。

(1)體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理,。1-2周后,，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖,，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體,。約1-2周，可見小鼠腹部膨大,。用注射器抽取腹水,，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),。在培養(yǎng)過程中,，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液,，離心去除細(xì)胞及其碎片,，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限,。各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn),，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。

單克隆抗體制備的意義：

用于以下各種生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)并具有醫(yī)用價(jià)值

(1)沉淀反應(yīng)：Precipitation reaction

(2)凝集實(shí)驗(yàn)：haemaglutination

(3)放射免疫學(xué)方法檢測免疫復(fù)合物

(4) 流式細(xì)胞儀：用于細(xì)胞的分型和細(xì)胞分離.

(5)ELISA 等免疫學(xué)檢測

(6)BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力 .

(7)免疫印記(western blotting)

(8) 免疫沉淀：

(9) 親和層析：分離蛋白質(zhì)

(10) 磁珠分離細(xì)胞

(11)臨床疾病的診斷和治療;