核酸提取作為分子實(shí)驗(yàn)的“第一步”，幾乎是所有實(shí)驗(yàn)的基本,，PCR,、qPCR、建庫測序等都需要核酸才能順利進(jìn)行,。核酸提取純化質(zhì)量是保證后續(xù)檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的前提,。

一，什么是核酸酶

核酸是一類由核苷酸聚合成的生物大分子,，是構(gòu)成生命所必需的基本物質(zhì)之一,，在生命系統(tǒng)中主要起到作為遺傳信息載體的作用，主要分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）,，其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(r RNA),，信使RNA（m RNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（t RNA）等。

核酸廣泛存在于所有動植物細(xì)胞,、微生物內(nèi),、生物體內(nèi)，常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白,。不同的核酸,，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同,。DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi),，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。

二,，核酸提取類型

1,，總RNA提取

總RNA中，75-85%為rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA）,，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA,、5S rRNA、5.8S rRNA,、miRNA,、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA,，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA,，snoRNA）等組成。

2,，miRNA提取

MicroRNAs（miRNAs）是小型的,、高度保守的RNA分子，如小干擾RNAs（siRNAs）,，通過與他們的堿基配對調(diào)節(jié)其同源mRNA的分子表達(dá),，以預(yù)防通過各種機(jī)制的表達(dá)。他們已成為進(jìn)行發(fā)育,、細(xì)胞增殖,、分化和細(xì)胞周期的重點(diǎn)監(jiān)管機(jī)構(gòu)。

3,，基因組DNA提取

進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因診斷,，通常要求得到的片段長度不小于100～200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,，以保證DNA的完整性,，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

4,，質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒抽提方法即去除RNA,，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì),，以得到相對純凈的質(zhì)粒,。

5，cfDNA提取和cfRNA提取

三,，傳統(tǒng)核酸酶提取實(shí)驗(yàn)原理

核酸提取實(shí)驗(yàn)涉及到兩個基本原理：細(xì)胞裂解和核酸沉淀,。

1，細(xì)胞裂解是將DNA從細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中釋放出來的過程,，在此過程中,，各種物理和化學(xué)手段如冰凍-破碎,、酶解和離子交換等可以使細(xì)胞破裂，釋放出核酸,；

2,，核酸沉淀則是將DNA從其他雜質(zhì)中分離出來的過程。這里的關(guān)鍵技巧是利用離心機(jī)和酒精洗滌,。離心機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)讓細(xì)胞碎片沉積在管底,，而酒精則幫助DNA在管壁上形成白色絮狀物，方便我們提取,。

四,，核酸提取純化方法解決

1，煮沸裂解法

此法一般用于DNA的手工提取,。染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大很多,，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)裝分子,；當(dāng)加熱處理DNA溶液時,，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉合的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象,；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,，從而可通過離心將兩者分開,。

2，磁珠法

對超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后,，制備成超順磁性氧化硅納米級磁珠,。該磁珠能與核酸分子特異性結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性,，在Chaotropic鹽(鹽酸胍,、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下，從血液,、動物組織,、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和RNA,。

3,，酚氯仿抽法

主要是使用兩種不同的有機(jī)溶劑交替抽提將蛋白去除。用苯酚處理勻漿液時,，由于蛋白與DNA的聯(lián)結(jié)鍵已斷,，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶，同時苯酚抑制了DNase的降解作用,，蛋白質(zhì)分子溶于酚相,，而DNA溶于水相,。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作,，再合并含DNA?的水相,，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA,。離心后,，DNA可取出。

4,，陰離子去污劑法

用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,，可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,，同時陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,，所以常用陰離子去污劑提取DNA。

5,，離心柱法

通過特殊硅基質(zhì)吸附材料,，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過,，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸,，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸,。離心柱純化也是試劑盒提取中廣泛的使用方法,。

6，熱裂解堿法

堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的,。堿性使質(zhì)粒DNA變性,，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA,，而染色體DNA不會復(fù)性,，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去,。

7,，CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨）,，是一種陽離子去污劑,，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提,，去除蛋白,、多糖,、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

8,，其他方法

除了上述常用的方法之外,，還有超聲法、酶解法及濃鹽法等等多種方法,。

五,，核酸分離注意事項(xiàng)與方案選擇

1，注意事項(xiàng)

分離純化核酸時,，為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究,，完整的一級結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在一級結(jié)構(gòu)之中,，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其它生物大分子結(jié)合的方式,。

? 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程,，以減少各種有害因素對核酸的破壞,；

? 減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸,、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞,，操作多在 pH4 - 10 的條件下進(jìn)行；

? 減少物理因素對核酸的降解,，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力,，其次是高溫；

? 防止核酸的生物降解,，細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵,，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu),。

2,，方案選擇

想要拿到好實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們應(yīng)該先學(xué)會根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求來選擇合適的方法,。核酸提取的方案,，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點(diǎn)而定，對于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子,，事先提取該細(xì)胞器,，然后提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子,。

六,，核酸純化提取應(yīng)用領(lǐng)域

核酸純化系統(tǒng)/核酸提取儀廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究和臨床診斷中的核酸提取和純化過程。具體應(yīng)用包括以下幾個方面：
1,，基因組學(xué)研究：核酸純化系統(tǒng)可以用于從細(xì)胞,、組織或體液樣本中提取并純化核酸,，為基因組測序、SNP分析,、CNV和突變檢測等提供高質(zhì)量的DNA/RNA樣品,。

2，蛋白質(zhì)研究：核酸純化系統(tǒng)可以用于從細(xì)胞裂解液中去除蛋白質(zhì),，使得后續(xù)的核酸分析更加準(zhǔn)確和靈敏,。在研究蛋白質(zhì)-DNA/RNA相互作用、染色質(zhì)組裝和修飾等方面具有重要作用,。

3,，臨床診斷：核酸純化系統(tǒng)在臨床診斷中非常重要。它可以用于從患者樣本中提取并純化病原體的核酸,，以進(jìn)行疾病診斷,、藥物敏感性分析和基因檢測等。常見的應(yīng)用包括病毒核酸提取,、細(xì)菌分離和基因突變篩查等,。

4，法醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)：核酸純化系統(tǒng)可以用于DNA提取和純化,，以進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定,、親子關(guān)系鑒定、人類遺傳學(xué)研究等,。這些研究和應(yīng)用需要高質(zhì)量的DNA樣本,，核酸純化系統(tǒng)能夠提供符合要求的純化效果。

逐典Pannarase全能核酸酶優(yōu)勢：

1.無動物源性,、無氨芐青霉素

2.杰出單位比酶活,、更高效的核酸降解能力

3.先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，非傳統(tǒng)His標(biāo)簽純化,、排除引入金屬離子風(fēng)險

4.嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),，內(nèi)毒水平低，確保單位酶活的準(zhǔn)確性以及批次間穩(wěn)定性

全能核酸酶應(yīng)用條件：

全能核酸酶的酶活會受到多種因素的影響（例如溫度,、pH,、離子強(qiáng)度等），故用量范圍也會從0.1 U/mL-250 U/mL不等,。因此,，不同的操作環(huán)境下酶的最佳濃度不同，需要通過實(shí)驗(yàn)設(shè)置梯度進(jìn)行最佳條件的摸索,。

應(yīng)用實(shí)例：

1.樣品：狂犬病毒濃縮液

處理?xiàng)l件:核酸酶濃度50~90U/ml ,

37 ℃處理 2 h,轉(zhuǎn)入18 ~ 26 ℃處理 6h

2.樣品：狂犬病病毒濃縮液

處理?xiàng)l件：25,、50和100 U/ml，37℃

3.樣品：流感病毒濃縮液

處理?xiàng)l件：10 U/mL,，37℃