GB4789.3-2016 大腸菌群計(jì)數(shù)及注意事項(xiàng)
01
大腸菌群定義和衛(wèi)生學(xué)意義

大腸菌群定義:
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖,、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名,,它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌,,而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括:埃希氏菌屬,、檸檬酸桿菌屬,、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬(又叫產(chǎn)氣桿菌屬,,包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌)和等,。

衛(wèi)生學(xué)意義:
大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評(píng)價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。表示了對(duì)人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性,。直接反映了樣品受糞便污染的程度,。

02
GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法
1
什么是MPN法?
MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,,根據(jù)其未生長(zhǎng)的zui低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度,,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù),實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn),,MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn),。
靈敏度較高,適用于污染菌落較少的樣品,。
2
大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)操作

操 作 注 意 事 項(xiàng)
1
建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液,,因?yàn)榱姿猁}緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用,。
2
初發(fā)酵接種量超過(guò)1mL,,則用雙料LST肉湯。
3
培養(yǎng)基檢查,。加入樣品前應(yīng)觀察導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡,,若有,應(yīng)適當(dāng)傾斜試管,,讓氣體排出,。
4
結(jié)果觀察。某些食品樣品可能會(huì)堵塞小導(dǎo)管底部,,影響導(dǎo)管內(nèi)氣泡的觀察,,可將試管微微傾斜,用手指輕彈管壁,,觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起,,若有,則判定產(chǎn)氣,。
3
培養(yǎng)基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST):
? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng),胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需求,;氯化鈉可維持均衡的滲透壓,;乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑,。
? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣,,則可停止培養(yǎng)。如果沒(méi)有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象,,則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h,。
? 如接種量超過(guò)1mL,則用雙料LST肉湯,。


煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB):
? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng),。
? 培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽,大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會(huì)與膽鹽發(fā)生反應(yīng),,形成膽酸沉淀,。培養(yǎng)基可由原來(lái)的綠色變?yōu)辄S色。


4
大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)報(bào)告
確證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數(shù),,檢索MPN表,,報(bào)告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值
當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無(wú)法查找到MPN值時(shí),,如:陽(yáng)性管數(shù)為122,123,,232,,233等時(shí),建議增加稀釋度(可做4~5個(gè)稀釋度),,使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定,,則多加一稀釋度),然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找,,最終確定MPN值,。
表B.1
大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表

03
GB4789.3-2016大腸菌群計(jì)數(shù)平板法
1
大腸菌群平板計(jì)數(shù)法流程圖

操 作 注 意 事 項(xiàng)
1
平板法相對(duì)MPN法來(lái)說(shuō),結(jié)果更加直觀精確,。長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的2~3或更多個(gè)細(xì)胞,。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。適用于污染較為嚴(yán)重的樣品,。
2
從一個(gè)樣品取樣到傾注瓊脂平板,,應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成。
3
檢驗(yàn)所用物品應(yīng)無(wú)菌,,無(wú)抑菌殘留物,。
4
BGLB確證試驗(yàn)需從VRBA平板上挑起至少10個(gè)典型和可疑菌落進(jìn)行,如平板上菌落數(shù)少于10個(gè),,則挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行確證,。
2
培養(yǎng)基原理解析
結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA):
? 配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌,中性紅作為指示劑,,在酸性條件下為紫紅色,。
? 大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合,可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán),。
? 該培養(yǎng)基無(wú)需高溫高壓滅菌,,現(xiàn)配現(xiàn)用。


3
計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)

大腸菌群定義:
選取菌落數(shù)在15CFU~150 CFU之間的平板,,分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落,。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),,菌落直徑為0.5mm或更大,。


證實(shí)試驗(yàn):
從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內(nèi),,36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性,。

4
大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告
經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),,再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù),。例:10-4樣品稀釋液1mL,,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管,,證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管,,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。
若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),,則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計(jì)算,。
04
質(zhì)量控制
實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中,每批樣品稀釋液都要做空白對(duì)照,。
為了控制環(huán)境污染,,每次檢驗(yàn)過(guò)程中,于檢驗(yàn)臺(tái)上打開(kāi)兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板,,并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15分鐘,,將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng),以掌握檢驗(yàn)過(guò)程中是否存在來(lái)自檢驗(yàn)環(huán)境的污染,。
定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品,,在P2實(shí)驗(yàn)室或陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)室內(nèi),用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,,并進(jìn)行記錄,,次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。

05
大腸菌群測(cè)試片法

1
原理
大腸菌群檢測(cè)片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐,,其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),、凝固劑、選擇抑制劑,、顯色劑)和透明隔水膜組成,,經(jīng)輻照滅菌,??捎糜谑称贰嬃系鹊拇竽c菌群計(jì)數(shù),。含有四氮唑指示劑菌落為紅色,,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣。
2
培養(yǎng)基原理解析
菌落計(jì)數(shù)特別方便(容易判讀),,紅色菌落,,易于食品顆粒分開(kāi),無(wú)菌落重疊現(xiàn)象;
菌落分布特別均勻,;
避免了培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌熱損傷有關(guān),;
菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生;
經(jīng)濟(jì)環(huán)保無(wú)粉塵,,體積小,,重量輕,易儲(chǔ)運(yùn),;
保質(zhì)期長(zhǎng)干制無(wú)水培養(yǎng)基,,性質(zhì)穩(wěn)定,保質(zhì)期更長(zhǎng),。
3
使用說(shuō)明

06
所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

專注微生物監(jiān)測(cè)控制,,為食藥安全保駕護(hù)航
微生物監(jiān)測(cè)控制整體解決方案的提供者
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