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細(xì)胞骨架(肌動(dòng)蛋白單體,;G-ACTIN)紅色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

來源:銘修(上海)生物科技有限公司   2024年04月08日 11:10  

細(xì)胞骨架(肌動(dòng)蛋白單體,;G-ACTIN)紅色熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書

(中文版)

主要用途

  細(xì)胞骨架(肌動(dòng)蛋白單體;G-ACTIN)紅色熒光染色試劑是一種旨在使用ALEXA染料標(biāo)記的DNAI,,探尋細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白單體的分布和局部定向變化狀況的典的技術(shù)方法,。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的,。主要適用于各種活體細(xì)胞(動(dòng)物,、人體、植物等)的細(xì)胞骨架裝配的檢測(cè),。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,,即到即用,反應(yīng)敏感,,操作簡(jiǎn)捷,,性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

肌動(dòng)蛋白(actin)是42KD的球蛋白,,構(gòu)成細(xì)胞骨架的微絲(microfilament)和肌肉收縮裝置的細(xì)肌絲(thin filament),,以及細(xì)胞膜表面?zhèn)巫悖?/span>pseudopodia微絨毛(microvilli,。肌動(dòng)蛋白存在于所有真核生物細(xì)胞中,且高度進(jìn)化保留,,參與各種重要細(xì)胞功能,,包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂,、肌肉收縮,、細(xì)胞形態(tài)維護(hù)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane trafficking 等,。哺乳動(dòng)物具有六種異構(gòu)體,,分成αβ,、γ三類,。球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)在生理?xiàng)l件下,,組合成長(zhǎng)絲聚合體,,轉(zhuǎn)化為絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin),形成細(xì)胞骨架的微絲,。肌動(dòng)蛋白的聚合與解聚的動(dòng)態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞骨架裝配(cytoskeleton assembly)的主要參數(shù)之一,。牛胰腺DNAIDNase I)具有與肌動(dòng)蛋白單體(G-actin)高度親和力結(jié)合的特征,因此通過ALEXA染料標(biāo)記的DNAI可以體外探測(cè)細(xì)胞G-肌動(dòng)蛋白的分布和含量,,據(jù)此分析細(xì)胞骨架裝配的調(diào)控機(jī)制,。

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液(Reagent A               毫升

  固著液(Reagent B             毫升

  通透液(Reagent C             毫升

  染色液(Reagent D           微升

  復(fù)染液(Reagent E           微升

產(chǎn)品說明書             1

保存方式

保存   染色液(Reagent D)和   復(fù)染液(Reagent E)在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融,;其余的保存在4℃冰箱里,,避免光照;有效保證3

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(GMS12024):用于細(xì)胞脫離

細(xì)胞培養(yǎng)液(GMS12052:用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于細(xì)胞染色的容器

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作

熒光(共聚焦)顯微鏡:用于細(xì)胞熒光觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,,將-20冰箱里的試劑置于室溫下凍融,。移取xx微升   通透液(Reagent C1.5毫升離心管,然后分別加入xx微升   染色液(Reagent D   復(fù)染液(Reagent E,,混勻后,,標(biāo)記為   染色工作液,置于冰槽里,,放進(jìn)暗室里備用,。然后進(jìn)行下列操作。

一,、 直接法

1. 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)6板,,內(nèi)置1個(gè)細(xì)胞1 X 1 cm大小的載玻片

2. 接種待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng),直至每孔鋪滿率達(dá)70

3. 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

4. 輕輕加xx   清理液(Reagent A到細(xì)胞載玻片上,,覆蓋樣品表面

5. 小心抽去   清理液(Reagent A

6. 輕輕加xx   固著液(Reagent B到細(xì)胞載玻片上,,覆蓋樣品表面

7. 室溫下孵育15分鐘

8. 小心抽去   固著液(Reagent B

9. 輕輕加xx   通透液(Reagent C到細(xì)胞載玻片上,,覆蓋樣品表面

10. 室溫下孵育5分鐘

11. 小心抽去   通透液(Reagent C

12. 輕輕加xx   清理液(Reagent A到細(xì)胞載玻片上,覆蓋樣品表面

13. 小心抽去   清理液(Reagent A

14. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1213二次

15. 小心xx微升   染色工作液,, 覆蓋樣品表面

16. 在暗室里室溫下孵育20分鐘

17. 小心抽去   染色工作液

18. 輕輕加xx   清理液(Reagent A到細(xì)胞載玻片上,,覆蓋樣品表面

19. 小心抽去   清理液(Reagent A

20. 封片

21. 即刻在熒光(共聚焦)顯微鏡下進(jìn)行觀察(每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)激發(fā)波長(zhǎng)590nm,散發(fā)波長(zhǎng)617nmG-肌動(dòng)蛋白染色)或激發(fā)波長(zhǎng)350nm,,散發(fā)波長(zhǎng)460nm(細(xì)胞核色)――

紅色熒光顯示G-肌動(dòng)蛋白,;藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

二、 間接法

1. 準(zhǔn)備1個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)的待測(cè)細(xì)胞,,直至鋪滿率達(dá)70%(約100萬細(xì)胞數(shù))

2. 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管(收集懸浮細(xì)胞)

3. 加入xx毫升   清理液(Reagent A,,覆蓋細(xì)胞表面

4. 小心移出xx毫升   清理液(Reagent A15毫升錐形離心管

5. 加入1升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿細(xì)胞表面

6. 放進(jìn)37培養(yǎng)箱孵育1分種

7. 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng),,使細(xì)胞脫落

8. 加入3毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

9. 移入15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞可以由此步開始)

10. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g

11. 小心抽去上清液

12. 加入xx   清理液(Reagent A,混勻

13. 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管

14. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g(或1500RPM,,例如EPPENDORF 5415

15. 小心抽去上清液

16. 加入xx   固著液(Reagent B,混勻

17. 室溫下孵育15分鐘

18. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g(或1500RPM,,例如EPPENDORF 5415

19. 小心抽去上清液

20. 加入xx   通透液(Reagent C,混勻

21. 室溫下孵育5分鐘

22. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g(或1500RPM,,例如EPPENDORF 5415

23. 小心抽去上清液

24. 加入xx   清理液(Reagent A,混勻

25. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g(或1500RPM,,例如EPPENDORF 5415

26. 小心抽去上清液

27. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2426二次

28. 加入xx微升   染色工作液

29. 200微升槍頭上下輕柔抽吸,混勻細(xì)胞顆粒群

30. 在暗室里室溫下孵育20分鐘

31. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g(或1500RPM,,例如EPPENDORF 5415

32. 小心抽去上清液

33. 加入xx   清理液(Reagent A,混勻

34. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,,速度為300g(或1500RPM,,例如EPPENDORF 5415

35. 小心抽去上清液

36. 加入xx微升   清理液(Reagent A,混勻

37. 即刻移取10微升在載玻片上壓片

38. 熒光(共聚焦)顯微鏡下進(jìn)行觀察(每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞)激發(fā)波長(zhǎng)590nm,,散發(fā)波長(zhǎng)617nmG-肌動(dòng)蛋白染色)或激發(fā)波長(zhǎng)350nm,,散發(fā)波長(zhǎng)460nm(細(xì)胞核色)――

紅色熒光顯示G-肌動(dòng)蛋白;藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核為圓環(huán)或橢圓狀

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品為10次操作

2. 在整個(gè)操作過程中須戴手套,,以防污染

3. 孵育時(shí),,必須避免光照

4. 建議檢測(cè)細(xì)胞量達(dá)106細(xì)胞數(shù)為佳

5. 用戶可以根據(jù)情況,適度調(diào)整試劑用量

6. 建議細(xì)胞染色完成后,,即刻進(jìn)行熒光分析,,不宜超過1小時(shí)

7. 本公司提供系列細(xì)胞骨架檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰



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