iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù),。iTRAQ技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán),，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較最多10種樣品之間的蛋白表達(dá)量,，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù),。

原理簡介

iTRAQ技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，通過對氨基酸N端和賴氨酸殘基進(jìn)行酶解后用iTRAQ試劑進(jìn)行特異性標(biāo)記,，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量。

iTRAQ試劑包括3個(gè)部分：報(bào)告基團(tuán)（Report group）,、平衡基團(tuán)（Balance group）和肽反應(yīng)基團(tuán)（Amine-specific reactive group）,。報(bào)告基團(tuán)相對分子質(zhì)量為113-121Da（無120），因此iTRAQ試劑可同時(shí)標(biāo)記8組樣品,。平衡基團(tuán)相對分子質(zhì)量為192-184Da（無185）,，使得八種iTRAQ試劑分子量均為305Da，保證標(biāo)記的同一肽段質(zhì)荷比（m/z）相同。肽反應(yīng)基團(tuán)將iTRAQ試劑與肽段的N端及賴氨酸的氨基特異結(jié)合,，在其上報(bào)告基團(tuán)通過平衡基團(tuán)與反應(yīng)基團(tuán)相連,，形成等量異位標(biāo)簽。

在串聯(lián)質(zhì)譜中,，來自不同樣品的同一肽段由于是等質(zhì)量的,，在一級質(zhì)譜檢測（MS1）中表現(xiàn)為一個(gè)母離子峰（即同一個(gè)質(zhì)譜峰），在二級質(zhì)譜檢測（MS2）中進(jìn)一步碎裂時(shí),，報(bào)告基團(tuán),、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失,，報(bào)告基團(tuán)則會產(chǎn)生相應(yīng)的不同質(zhì)量數(shù)的報(bào)告離子,，它們各自質(zhì)譜峰的信號強(qiáng)弱，代表著來源于不同樣品的該肽段及其所對應(yīng)的蛋白的表達(dá)量的高低,。因此,，根據(jù)報(bào)告離子的信號強(qiáng)度值即可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息,。同時(shí)，多肽內(nèi)的酰胺鍵斷裂,，形成一系列b離子和y離子,，得到離子片段的質(zhì)量數(shù)，通過數(shù)據(jù)庫查詢和比較,，可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)前體,。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取和質(zhì)控——iTRAQ標(biāo)記肽段——HPLC分級——質(zhì)譜分析——數(shù)據(jù)庫處理——生物信息學(xué)分析

圖1 iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程圖。

TMT（Tandem Mass Tag）技術(shù)是由美國Thermo Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù),。與iTRAQ技術(shù)原理相同，優(yōu)勢類似,，但是比iTRAQ擁有更多的標(biāo)簽數(shù),，能一次上機(jī)更多樣品。

原理簡介

TMT技術(shù)采用2種,、6種,、10種或16種同位素標(biāo)簽，特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán),，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,，監(jiān)測碎裂下來的標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)肽段定量。一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)比較最多16組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量,。

TMT標(biāo)簽由三部分組成：分子量報(bào)告子（報(bào)告基團(tuán)）,、分子量標(biāo)準(zhǔn)化部分（平衡基團(tuán)）和（肽）反應(yīng)基團(tuán)，形成2種、6種,、10種或16種相對分子質(zhì)量均為等量的異位標(biāo)簽,。TMT試劑通過反應(yīng)基團(tuán)與肽段上賴氨酸及N端氨基酸殘基相連，能夠高效地標(biāo)記酶解后的肽段,。在一級質(zhì)譜中,，分子量標(biāo)準(zhǔn)化部分使任何一種TMT試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一肽段表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在二級質(zhì)譜中,，釋放出分子量報(bào)告子,。每個(gè)報(bào)告子都有各自du特的分子量，產(chǎn)生不同的報(bào)告離子峰,，其強(qiáng)度反應(yīng)了該肽段在不同樣品中的相對表達(dá)量信息,，另外二級質(zhì)譜中的肽段碎片離子峰質(zhì)荷比反應(yīng)了該肽段的序列信息，根據(jù)這些質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)可得到蛋白質(zhì)的定性和相對定量信息,。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取和質(zhì)控——TMT標(biāo)記肽段——HPLC分級——質(zhì)譜分析——數(shù)據(jù)庫處理——生物信息學(xué)分析

SILAC即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC),。SILAC是一種通過使用13C-葡萄糖,、15NH或3C標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基引入穩(wěn)定同位素，標(biāo)記細(xì)胞或小生物體內(nèi)的蛋白并根據(jù)質(zhì)譜豐度比率進(jìn)行定量的體內(nèi)代謝標(biāo)記技術(shù),。

最初SILAC使用的標(biāo)記氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸,，目前常用的標(biāo)記氨基酸有亮氨酸、精氨酸,、賴氨酸,、甲硫氨酸和酪氨酸等。

原理簡介

在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入天然同位素（輕型）或穩(wěn)定同位素（重型）標(biāo)記的必需氨基酸,，替代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)的氨基酸,，細(xì)胞經(jīng)若干傳代后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸wan全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中,，取代了原有的氨基酸,。這樣，兩個(gè)蛋白之間就存在分子量的改變,，而其它化學(xué)性質(zhì)無異,。然后將兩組細(xì)胞混合，提取蛋白質(zhì),，經(jīng)分離純化后進(jìn)行質(zhì)譜測定,。

每個(gè)肽段作為質(zhì)譜中的一對：低分子量的肽段含有輕型氨基酸，來源于A組,，高分子量的肽段則含有重型氨基酸,，來源于B組,。如果SILAC肽段對呈現(xiàn)1：1的比例，則蛋白質(zhì)組中此蛋白的豐度無差異,。如果含有重型氨基酸的肽段峰強(qiáng)度偏高,，則說明B組中蛋白豐度更高。因?yàn)榉€(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸與天然氨基酸的化學(xué)性質(zhì)基本相同,，除了分子量有差異,。因此，質(zhì)譜上峰強(qiáng)度的比值直接對應(yīng)了A組與B組的比例,，即可對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量,。

實(shí)驗(yàn)流程

細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記——蛋白提純——1:1混合蛋白樣品——蛋白還原、酶切——LC-MS液質(zhì)串聯(lián)檢測——生物信息學(xué)分析

圖2 SILAC實(shí)驗(yàn)流程圖,。

蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（Label-free）是經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。該技術(shù)無需昂貴的同位素（iTRAQ和TMT）標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo),，而是通過比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度,，分析不同來源樣品蛋白的數(shù)量變化。該方法認(rèn)為肽段在質(zhì)譜中被捕獲檢測的頻率與其在混合物中的豐度成正相關(guān),，因此蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測的計(jì)數(shù)反映了蛋白質(zhì)的豐度,，通過適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)公式可以將質(zhì)譜檢測計(jì)數(shù)與蛋白質(zhì)的量聯(lián)系起來，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,。

原理簡介

Label-free通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析,，按照其原理主要分為兩種，di一種Spectrum counts類的非標(biāo)記方法,，發(fā)展比較早，已經(jīng)形成多種定量算法,。其主要的原理是以MS2的鑒定結(jié)果為定量基礎(chǔ),，各種方法的差別在于后期算法在大規(guī)模數(shù)據(jù)上的修正。第二種非標(biāo)記定量的原理是以MS1為基礎(chǔ),，計(jì)算每個(gè)肽段的信號強(qiáng)度在LC-MS上的積分（如Maxquant）,，以積分面積對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提取——蛋白酶解——高效液相HPLC預(yù)分離——MS質(zhì)譜分離——原始數(shù)據(jù)搜庫分析——生物信息學(xué)分析

圖3 Label-free實(shí)驗(yàn)流程圖,。

DIA（Data-independent acquisition）技術(shù)是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold博士及其團(tuán)隊(duì)與AB-SCIEX公司聯(lián)合研發(fā)的一項(xiàng)全新質(zhì)譜技術(shù)，而SWATH（Sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions）便是基于DIA采集模式的一種新技術(shù),。

DIA采集模式將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)小窗口,，然后依次對每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行檢測、碎裂,，使其能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)的所有肽段離子進(jìn)行高速一級MS掃描,，再進(jìn)行二級MS/MS分析,，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息,，在碎片離子層面完整重現(xiàn)nanoLC的色譜峰圖,，因此DIA定量可以利用碎片離子隨時(shí)間的積分來表征肽段含量，而利用二級碎片離子定量不僅可以降低樣本檢測的缺失值,，同時(shí)提高定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性,，實(shí)現(xiàn)大樣本隊(duì)列中高覆蓋率，高穩(wěn)定,，高精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組定量分析,。但本質(zhì)上，DIA也是一種Label-free定量方法,。

原理簡介

DIA/SWATH技術(shù)將掃描范圍劃分為以25 Dalton為間隔的一系列區(qū)間,，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。以蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分析中常見的掃描范圍400~1200為例,，每25 Dalton作為一個(gè)掃描間隔（SWATH）,，每個(gè)SWATH掃描時(shí)間設(shè)定為100 ms，那么該掃描范圍累計(jì)需要32個(gè)SWATH（1200-400/25=32）,，完成一次掃描僅需要3.2秒,。

與傳統(tǒng)的shotgun技術(shù)相比，SWATH技術(shù)能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)所有的肽段母離子經(jīng)過超高速掃描并進(jìn)行二級碎裂,，使用二級碎片離子進(jìn)行蛋白相對/jue對定量,，從而獲得完整的肽段信息。

目前SWATH可以根據(jù)樣品TIC分布進(jìn)行窗口優(yōu)化,，從而獲取更多的譜圖信息,，提高了精準(zhǔn)度和分辨率。通過高分辨高靈敏質(zhì)譜TripleTOF 5600/+以及zuixin的TripleTOF 6600進(jìn)行分析掃描,。因此,，SWATH技術(shù)是一種真正全景式的、高通量的質(zhì)譜技術(shù),，同時(shí)也解決了shotgun鑒定重復(fù)度較低的缺點(diǎn),。

實(shí)驗(yàn)流程

蛋白提純——蛋白還原、酶切——HPLC分離肽段——LC-SWATH模式質(zhì)譜檢測——OpenMS分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)——生物信息學(xué)分析

圖4 SWATH實(shí)驗(yàn)流程圖,。

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