一,、測定標準

參考食品國家標準：GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。

二、操作過程

1,、前期準備：

根據國家標準,，提前準備好要用的平板計數瓊脂,、平皿,、試管、稀釋液（生理鹽水）,、三角燒瓶等,，相應的材料進行滅菌處理（干熱滅菌或高壓滅菌）。

2,、接收樣品：

收到樣品后,，確認樣品包裝是否完好，登記樣品信息,，并將其保存在2~8℃冰箱中,，然后在取樣時取出。

3,、樣品處理：

按照作業(yè)指導書操作,，仔細閱讀實驗要求。一般實驗室收到的是干粉樣品,、固體樣品,、或者液體樣品等。假如收到干粉樣品,，那么首先需要將其配置成水溶液（即水化）,。根據實驗要求及經驗，進行預判,，預估稀釋液倍數，溶解即可,。

4,、實驗前準備：

4.1實驗操作最好在超凈臺或者生物安全柜里操作，需要把超凈臺或者生物安全柜提前清理,、消毒處理,，確保實驗環(huán)境無菌。

4.2提前把要用到的平皿、試管,、稀釋液等放到操作臺上紫外殺菌,。

5、實驗操作：

5.1稀釋

將樣品從冰箱中取出達到室溫后開始取樣,，在超潔凈臺或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化后吸入無菌瓶或袋中,，再用剩余的稀釋液進行洗滌并全部轉入無菌瓶或袋中。

洗滌轉移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作,，將全部的水化液進行均質混勻,，一般作為原液立刻進行接種；再取25ml到225ml稀釋液中均質混勻,，制成10-1梯度樣品勻液,。

用1ml無菌吸管取1:10的樣液到9ml生理鹽水試管中，制成1:100的樣液,，以此類推,。再將幾個稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無菌平皿中。

5.2傾注平板

將提前在水浴鍋里涼至46℃的平板計數營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml,，并轉動平皿,，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照,。傾注過程一般左手拿平皿,，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開30°左右的縫隙,，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處,，左三圈、右三圈輕輕混勻,，然后放到臺面上,。待瓊脂凝固后，翻轉平板,，置36±1℃溫箱內培養(yǎng)48±2h,。

5.3觀察計數

24h觀察檢測結果有無異常現象,，是否有蔓延菌落出現,。48h再按照GB 4789.2的要求進行菌落計數。在對結果進行分析后,，選取檢測結果的平均值為最終數據,。

三、注意事項

1,、當無法預判樣品菌落總數含量時,，需要梯度稀釋，此步驟尤其關鍵，必須盡可能地減少誤差,。

2,、傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長,，過低瓊脂易凝固,，不能與菌液充分混勻。如無水浴條件,，應以皮膚感受較熱而不燙為宜,。

3、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一,，從12~20ml不等,，一般以15ml較為適宜，平板過厚會影響觀察,，太薄又易于干裂,。傾注時，培基底部如有沉淀物,，應將底部棄去,，以免與菌落混淆而影響計數觀察。

4,、傾注過程力度一定掌握好,，絕不能把瓊脂濺出來。

5,、為使菌落能在平板上均勻分布,，檢液加入平皿時要盡可能放在中央部位，然后應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻,，可正反兩個方向旋轉,，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不易過長，以防止細菌有所死亡或繁殖,。

6,、瓊脂培養(yǎng)基放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現平皿不凝固現象,；拿出傾注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈,。

7、冷卻的過程不要著急,，冷卻充分后再倒置放進培養(yǎng)箱培養(yǎng),，放置的時候要盡量避免放到風機口處，每摞不要超過6個平皿,。

8,、檢測結束后所有的稀釋液樣品可放到冰箱里0-5℃冷藏，以備實驗出錯時再用,。

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