使用NINJ1抗體抑制膜撕裂限制組織損傷

背景部分介紹：

NINJ1是一種16 kDa的細(xì)胞表面蛋白,，預(yù)計具有兩個跨膜區(qū)域，并且在細(xì)胞外部具有N和C端,。雖然對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)是非必要的，但NINJ1控制著細(xì)胞凋亡或焦亡的一個重要后果,，介導(dǎo)PMR （plasma membrane rupture）,，非選擇性地從死亡細(xì)胞中釋放促炎細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物。NINJ1依賴性PMR是否會加重疾病中的組織損傷尚不清楚,，但據(jù)報道,，在小鼠模型中，Ninj1缺乏可減輕肺纖維化和多發(fā)性硬化癥,。鑒于NINJ1的一個保守的細(xì)胞外區(qū)域?qū)ζ涔丫刍蚉MR至關(guān)重要,，作者假設(shè)細(xì)胞外抗NINJ1抗體可以用來抑制體內(nèi)依賴NINJ的PMR。

在介紹本文內(nèi)容前,，推薦兩篇相關(guān)的文獻(xiàn),，希望為大家提供更好的背景方面的了解。

第一篇如下,，NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death, 是由同一作者于2021年發(fā)表于nature的文章,，初步描述了NINJ1在細(xì)胞焦亡過程中對質(zhì)膜撕裂的作用。

第二篇,，structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death, 巧合的是這篇文章與我們要解析的文章同一天發(fā)表在nature上,，但作者不同。這篇文章詳細(xì)解析了NINJ1的空間構(gòu)象,。

在NINJ1出現(xiàn)之前,，大家普遍認(rèn)為細(xì)胞焦亡過程中，細(xì)胞腫脹后引起的質(zhì)膜撕裂是被動的,，隨著關(guān)于NINJ1在nature的三篇文章出現(xiàn),，相信大家對該基因的重要性有了共同認(rèn)識，那么接下來NINJ1是否會成為細(xì)胞死亡領(lǐng)域里的研究新寵呢,？

主要結(jié)果部分：

1.NINJ1阻斷抗體克隆D1的鑒定

為了產(chǎn)生Ninj1阻斷抗體,，作者用表達(dá)全長小鼠NINJ1的細(xì)胞外囊泡免疫Ninj1?/?小鼠a,。通過流式細(xì)胞術(shù)分析分離了大約15000個結(jié)合NINJ1的IgM?B細(xì)胞，并鑒定了單細(xì)胞上清與表達(dá)NINJ1的細(xì)胞的結(jié)合,。217個重組抗小鼠NINJ1 IgG2a單克隆抗體的功能篩選鑒定克隆D1 (NINJ1- 575)為NINJ1依賴性PMR抑制劑b,。另外驗證了D1只結(jié)合鼠NINJ1 C?？寺1識別NINJ1的C端表位,，而對照克隆25識別N端表位d。

2. D1可有效抑制NINJ1依賴性PMR

為了擴(kuò)展對BMDMs的分析,，我們通過延時活細(xì)胞成像來監(jiān)測NINJ1依賴性PMR,。用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的150 kDa葡聚糖(DD-150)裝載Pam3CSK4-primed BMDMs，并使用尼日利亞菌素刺激后的染料釋放量作為PMR的指標(biāo),，發(fā)現(xiàn)克隆25和D1均表現(xiàn)出PMR阻斷活性,，但后者更有效a。雖然二者都能阻斷PMR,，但不能抑制膨脹泡的形成c,。

3. 克隆D1減弱了NINJ1的寡聚化

假設(shè)克隆D1通過阻止NINJ1的寡聚化來阻斷BMDMs中的PMR。為了與這種機制保持一致,，尼日利亞菌素在野生型bmdm中誘導(dǎo)了NINJ1的斑點狀組裝,，但這些在D1 Fab克隆存在時不那么普遍a, b。還檢測了克隆D1對瞬時轉(zhuǎn)染人Expi293F細(xì)胞純化的n端flag標(biāo)記小鼠NINJ1的影響,。通過隔離層析(SEC),，純化后的Flag-NINJ1作為高分子量的物種遷移(在8.5 ml保留體積時達(dá)到峰值)，相比之下,，當(dāng)Flag-NINJ1與克隆D1 Fab共表達(dá)時,，純化的NINJ1-Fab復(fù)合物以低分子量的物種遷移(在15ml保留體積時達(dá)到峰值)。c,。另陰性染色電鏡顯示,，F(xiàn)lag-NINJ1形成了形狀各異的低聚結(jié)構(gòu)，包括環(huán)狀,、長絲,、團(tuán)簇和圓弧，其尺寸可達(dá)200 nm,，與D1 Fab共存在時無高階低聚物結(jié)構(gòu)形成d,。

4. 克隆D1限制了NINJ1依賴性PMR和DAMP的釋放

該實驗采用了小鼠模型NINJ1fl/flRosa26-creERT2 mice: 該小鼠品系能夠在成年鼠中引起他莫昔芬誘導(dǎo)的系統(tǒng)性NINJ1缺失。

a-d探討了NINJ1在細(xì)胞凋亡相關(guān)PMR中的作用：

在他莫昔芬治療后,，NINJ1fl /flRosa26-creERT2小鼠和Rosa26-creERT2對照小鼠給予TNF和轉(zhuǎn)錄抑制劑D-半乳糖胺(D-Gal)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,，TNF +D-Gal引起Rosa26-creERT2小鼠的暴發(fā)性肝細(xì)胞PMR，血清中ALT、AST和LDH升高,，而TNF + D-Gal處理的NINJ1缺陷小鼠血清中ALT,、AST和LDH含量顯著較低a。對照肝臟的組織學(xué)分析顯示,，TNF + d-Gal引起以收縮性肝細(xì)胞死亡伴出血為特征的大面積病變,，NINJ1缺陷肝細(xì)胞表現(xiàn)出與PMR功能障礙相關(guān)的腫脹形態(tài)b, c。免疫標(biāo)記顯示,，這些病變中裂解的caspase-3（細(xì)胞凋亡的標(biāo)志）呈陽性d,。這些數(shù)據(jù)表明NINJ1在體內(nèi)介導(dǎo)凋亡相關(guān)的PMR。

接下來,，檢測克隆D1是否可以限制TNF + d-Gal誘導(dǎo)的肝損傷e-g：

野生型小鼠在注射TNF + D-Gal前2小時給予同型對照抗體,，血清ALT、AST和LDH水平顯著升高,，表明肝細(xì)胞PMR增強,，與NINJ1缺乏癥類似，D1克隆預(yù)處理顯著減弱誘導(dǎo)的血清LDH,、ALT和AST升高e,。隨后發(fā)現(xiàn)TNF + D-Gal以NINJ1依賴的方式增加了血清中DAMPs IL-18和HMGB127的水平f, g。

模式圖推測：

最后,，針對文章的研究,，小優(yōu)博士在這里制作了一張推測的模式圖,，供大家參考,。

部分產(chǎn)品推薦：