所謂Real-Time PCR技術(shù),,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析,。real-time PCR技術(shù)即實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差,提高實驗的重復(fù)性,。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細胞mRNA表達量的變化,;比較不同組織的mRNA表達差異;驗證基因芯片,,siRNA干擾的實驗結(jié)果,。
Real-Time PCR操作流程
Real-Time PCR操作流程
- 根據(jù)已知全長基因序列及待檢基因的背景信息,設(shè)計并合成Realtime PCR引物
- RNA抽提:提供組織,、細胞等來源樣本的RNA抽提服務(wù),,并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
- 制備標準曲線樣品
- 標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中,進行RealTime PCR擴增和檢測
- 檢測結(jié)果進行標準曲線分析
- 提供實驗報告:包括詳細的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表,。
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