聚乙二醇(polyethylene glycol,,PEG)是一種無電荷的直鏈大分子多糖,,可非特異性地引起蛋白質(zhì)沉淀,。沉淀具有可逆性,被沉淀的蛋白質(zhì)生物活性亦不受影響,。不同濃度的PEG可沉淀分子量不同的蛋白質(zhì),,在pH值、離子濃度等條件固定時,,蛋白質(zhì)分子量越大,,用以沉淀的PEG濃度越小。由于PEG 6000對蛋白質(zhì)沉淀具有良好的選擇性,,所以在IC測定中主要采用PEG 6000。
PEG使IC沉淀的機理可能在于使其自液相中空間排斥而析出,,此外,,PEG還可抑制CIC解離,促進CIC進一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀,。在被檢血清中加入低濃度PEG,,可將血清中的IC沉淀下來,利用透光率比濁或散射比濁法可測出CIC的存在與含量,。本法簡便易行,,國內(nèi)已廣泛應用。
(一)試劑
1.0.1mol/L pH8.4硼酸鹽緩沖液(borate buffer solution,BBS) 硼酸(H3B03)3.40g,,硼砂(Na2B407·10H20)4.29g,,蒸餾水溶解后,加至1 000mL,。用G3或G4玻璃濾器過濾,。
2.PEG-NaF稀釋液 PEG 6 000 40.9g,NaF 10.0g,,用BBS溶解后加至1 000mL,,用G3或G4玻璃濾器過濾。
3.熱聚合人IgG 將人IgC(10mg/mL)置63℃水浴加熱15rain,,立即置冰浴內(nèi),,冷卻后過Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱,收集*蛋白峰,。所獲熱聚合人IgG可用考馬斯亮藍法測定蛋白含量,。也可取人IgG(10mg/mL)10mL,攪拌下滴加1.8%戊二醛100uL,,24h后加入0.4mol/LpH5.4,,Tris-HCl緩沖液100uL終止反應,過Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱,,用0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液洗脫,,收集*蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0.5%,,分裝后—40℃保存,。試驗中可用作陽性對照和制備標準曲線。
(二)操作步驟
1.取待測血清0.15mL,,加BBS0.3mL(1:3稀釋),。
2.按表10—1加入各液(待測血清zui終稀釋倍數(shù)為1:33,PEGzui終濃度為3.64%),。
3.將測試管及對照管置37℃水浴60rrfin,。
4.分光光度計在波長495nm測吸光度,用對照管調(diào)零,。
(三)結(jié)果判斷
待測血清濁度值:(測定管吸光度—對照管吸光度)X100,。以大于正常人濁度值的均值加2個標準差為CIC陽性。
參考值:4.3±2.0,,以大于或等于8.3為CIC陽性,。或以不同濃度熱聚合人IgG按以上方法操作制備標準曲線,,根據(jù)待測血清吸光度值查標準曲線,,即可得IC含量(相當于熱聚合人IgG的ug/mL),。
(四)注意事項
1.低密度脂蛋白可引起濁度增加,故應空腹采血,。
2.高丙球血癥或血脂含量過高及標本反復凍融,,均可導致IC檢測出現(xiàn)假陽性。
3.此法快速,、簡便,,但特異性較差,較適用于血清標本的篩查,。
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