一,、原理

蛋白質(zhì)免疫印跡法即Western Blot,。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法,，基本原理是經(jīng)過 PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上,，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,。

二,、流程圖：

(一)蛋白上清液提取：

a,、準(zhǔn)備工作：分裝需要體積的蛋白裂解液（IP/RIPA）,，再分別加蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：PMSF 體積比為100:1），磷酸化蛋白酶抑制劑（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制劑體積比為100:2）于蛋白裂解液中,，加入Aprotinin 蛋白酶抑制劑,，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）體積比為 100:0.2；

b,、剪取適量組織（盡量保證每一粒樣品都剪去的一樣多）和適量混勻的蛋白裂解液于勻漿器中磨勻（0.01g組織加上50-100ul的蛋白裂解液）,，直至看不見組織塊；

c,、轉(zhuǎn)移勻漿液于 1.5ml 離心管中,，置于冰上蛋白裂解10min；

d,、提前開離心機(jī)預(yù)冷,，4℃，12000rpm 離心 15min ,；

e,、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 1.5ml 新的離心管中，部分用于實驗多余的存于-20℃,；

若實驗對象為細(xì)胞：懸浮細(xì)胞,、貼壁細(xì)胞

懸浮細(xì)胞：

①收細(xì)胞：細(xì)胞懸液收集到離心管中，5000rpm,，去上清,，加1mlPBS，5000rpm,，5min,，加50ulIP/RIPA裂解液，冰上裂解20-30min,；

②打蛋白：超聲儀,，探頭使用前用純水清洗,，探頭伸入液面以下，避免太多,；設(shè)置程序：（打3s,，停3s，共計92次）,；破碎細(xì)胞后,，4℃，12000rpm,，10min離心,，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃,。

注意：

①貼壁細(xì)胞：先用PBS緩沖液清洗兩遍,，然后加入蛋白裂解液（IP/RIPA），然后用細(xì)胞刮板將細(xì)胞+蛋白裂解液移至離心管中,。

②一管細(xì)胞打20次左右,，打蛋白的過程中會發(fā)熱，可暫停置于冰上數(shù)秒,。

BCA測蛋白濃度：（通常利用BCA試劑盒測定）,，基本流程如下：

96孔板：（一般最外圍的孔不利用或加等體積的PBS溶液防止污染和蒸發(fā)）

（1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA做標(biāo)曲，取7個EP管,，編號①-⑦

（2）濃度：①2,、②1、③0.5,、④0.25,、⑤0.125、⑥0.0625,、⑦0（單位：mg/ml）

（3）②-⑦+50ulPBS,，①-②+50ulBSA

（4）②混勻，取50ul加③,，依次加到⑥

（5）配樣品濃度：45ulPBS+5ul樣品濃度,，配完短暫離心混勻（計算濃度時×10）

（6）配制工作液，配完避光,，現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=50:1,，一個孔要200ul工作液）：一個樣要2個重復(fù)孔，計算體系：7個標(biāo)準(zhǔn)品+1個待測液溶液×2,，共計16孔,；防止加樣誤差，配置20個體系,，一個200ul（20×200=4000ul/4ml）

（7）加樣到96孔板：一個孔：20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液,；標(biāo)準(zhǔn)品從⑦-①加,，兩個平行孔一起加。

（8）37℃孵育30min（孔板底部勿觸碰,，保持干凈）

1. 測562nm處OD值,，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（excel）
   
   

(三)電泳

1,、配制上樣體系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS 蛋白上樣量：20-50ug

5,、蓋上電源蓋，正負(fù)極相互對應(yīng),，接通電源,，恒壓濃縮膠80V，30min或maker分離后可更改電壓為120v,，跑分離膠,。待 loading buffer中的溴酚藍(lán)跑至腳底部 1cm 處停止電泳。整個時間大概為 1.5h-2h,。

2,、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次,。

注意：一抗,，二抗孵育洗膜時間可以靈活調(diào)整,，一般3-5次，5min一次

Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀釋液

致局部短路,，也散發(fā)熱量,。

2、條帶畸形最主要可能是膠沒有混勻,，轉(zhuǎn)膜過程中膠與膜中間有氣泡,。條

帶拖尾，應(yīng)該是蛋白雜質(zhì)較多,。

3,、 配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多,。盡管玻璃看

似平滑,，但是一些細(xì)微的凹陷處會凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒或疙瘩,，可能會導(dǎo)致在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊,，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形,。

4,、背景深

（3）縮短二抗孵育時間,；

5 ,、沒有條帶

若麗春紅染色沒有條帶，則可以放棄此膜,，轉(zhuǎn)膜前面的步驟哪里出錯,，有可能蛋白濃度低或蛋白未提出。

6 、曝光過后,，若是β-actin 這樣的內(nèi)參很明顯的降解成了兩條帶,，則說明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巰基乙醇這類的還原劑失效。

9 ,、APS（過硫酸銨）會失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個月左右,，APS失效膠會不凝,，要4℃避光保存。

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