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炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)與染料疊氮化物或炔烴的綴合

來源:上海牧榮生物科技有限公司   2024年03月12日 16:29  

蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液適用于 CuAAC 與蛋白質(zhì)的反應(yīng),可保護(hù)生物分子免受活性氧的損害,。該反應(yīng)可用于具有炔烴或疊氮基團(tuán)的蛋白質(zhì),,以及用疊氮基團(tuán)代謝標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物的組分。

疊氮化物與末端炔烴綴合,,形成五元雜環(huán)(1,2,3-三唑),。這兩個(gè)基團(tuán)(疊氮基和炔烴)在天然生物分子中都極為罕見,,因此該反應(yīng)具有高度特異性,,可以有效地處理各種任務(wù)。

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該反應(yīng)在銅 (I) 化合物存在下進(jìn)行,,幾乎不依賴于 pH 值,。蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液針對(duì)蛋白質(zhì)操作進(jìn)行了優(yōu)化,,含有銅 (II) 鹽(催化活性銅 (I) 化合物的穩(wěn)定前體)、醋酸三乙銨 pH 6.8,、水溶性 THPTA 配體和氨基胍,。建議使用新鮮配制的 抗壞血酸溶液減少銅(II)。蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液中的 THPTA 配體通過穩(wěn)定銅 (I) 的催化活性化合物來加速反應(yīng),。 THPTA 配體的存在還允許在水介質(zhì)(無(wú)有機(jī)溶劑)中進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記,,并且由于銅 (I) 氧化程度的穩(wěn)定,最大限度地減少活性氧 (RAS) 的產(chǎn)生,,并防止它們通過氧化組氨酸,、蛋氨酸來?yè)p壞蛋白質(zhì)和半胱氨酸。蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液中的氨基胍可防止化學(xué)反應(yīng)性醛(脫氫抗壞血酸水解產(chǎn)物)與精氨酸,、N 末端半胱氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈結(jié)合,。

對(duì)于此反應(yīng),您將需要無(wú)疊氮鈉緩沖液中的炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質(zhì),、疊氮染料或 炔烴,、1.5х蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液抗壞血酸。建議在惰性氣體(氮?dú)饣驓鍤猓┫聢?zhí)行步驟 6 至 9,。

協(xié)議

我們推薦以下方案用于修飾蛋白質(zhì)與染料衍生物的綴合:

  1. 根據(jù)要使用的修飾蛋白的量確定總反應(yīng)體積:

    ,!炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)溶液的體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的1/3。

    總反應(yīng)體積,,μL蛋白質(zhì)含量
    1004至20納摩爾
    20020至40納摩爾
    40040至80納摩爾
    60080 至 600 納摩爾
  2. 使用下表計(jì)算標(biāo)記反應(yīng)的試劑體積:

    試劑體積,,微升原液濃度
    染料疊氮化物或炔烴(蛋白質(zhì)含量 [nmol])× 0.3*10 mM DMSO 或水
    蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液(總反應(yīng)體積[μL])×0.671.5倍
    活化劑(抗壞血酸)(總反應(yīng)體積[μL])×0.0250 mM 水中
    (總反應(yīng)體積 [μL] – 染料溶液體積 [μL] – 蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液體積 [μL] – 活化劑溶液體積 [μL])

    * 染料過量可能會(huì)根據(jù)蛋白質(zhì)分子上疊氮化物或炔基的數(shù)量而變化。表中顯示的計(jì)算結(jié)果為 3 倍過量的染料,。對(duì)于 1.5–10 倍過量的染料,,將蛋白質(zhì)含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但請(qǐng)記住,,如果您使用不溶于水的疊氮化物或炔烴,,則過量時(shí)它可能會(huì)從反應(yīng)混合物中沉淀出來。使用水溶性染料,,例如磺化花青染料sulfo-Cyanine,。

  3. 準(zhǔn)備 染料疊氮化物或炔烴(10 mM 溶于 DMSO 或水中,適用于水溶性炔烴和疊氮化物)和活化劑(抗壞血酸,,50 mM 水溶液)的儲(chǔ)備溶液,。

    請(qǐng)記住,抗壞血酸在空氣中很容易氧化,。僅使用新配制的活化劑溶液 (該溶液在 1 天內(nèi)穩(wěn)定),。要制備儲(chǔ)備溶液,請(qǐng)將 10 mg 抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中,。

  4. 蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液添加到修飾的蛋白質(zhì)溶液中并渦旋,。

  5. 添加計(jì)算體積的疊 氮化染料或炔烴儲(chǔ)備溶液,,并再次渦旋均勻。

  6. (推薦)對(duì)混合物進(jìn)行脫氣以除去氧氣,。為此,,將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管,該管連接到裝有惰性氣體(氬氣或氮?dú)猓┑臍馄康膲毫φ{(diào)節(jié)器,。打開非常弱的氣流,,放入管中,使其比液面高 3-10 毫米,,避免接觸液體和管壁,。氣流應(yīng)在液體中形成漩渦而不濺出液體。將保持在該位置 10-20 秒,。

    如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)標(biāo)記反應(yīng),,可以使用離心濃縮器進(jìn)行脫氣。為此,,將管子放入濃縮器中,,打開旋轉(zhuǎn),打開真空 30-40 秒,,然后關(guān)閉真空,,同時(shí)向系統(tǒng)輸入端輸送惰性氣體。

  7. 添加活化劑溶液(抗壞血酸),,然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關(guān)閉它,。

  8. 渦旋溶液。

  9. 讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時(shí),。

  10. 使用透析或尺寸排阻色譜分離染料-蛋白質(zhì)綴合物,。


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