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Trizol是一種酸性試劑,，能從細胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚,。裂解細胞后,，GITC能使蛋白質和RNase變性,，有利于保護RNA的完整性,；加入氯仿離心后,，樣品分為水相和有機相，RNA存在于上層水相中,，而DNA和蛋白質則存在于中間層及下層有機相中,，從而達到分離的目的。簡單來講就是裂解細胞使RNA得以釋放，加之有機溶劑使RNA與DNA,、蛋白質分離,，并進一步純化得到RNA的過程。那么你知道Trizol法RNA提取的實驗流程和注意事項是什么嗎,？讓我們一起來看看吧,！
1.樣品的制備
1)細胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細胞的比例加入Trizol試劑(注：一般來講待細胞在六孔板上生長至80%左右時，每孔收集的細胞加1ml Trizol即可),；
2)組織：按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理,，以利于RNA的釋放(注：組織可以先用液氮急凍后研磨處理，也可用勻漿器或者組織研磨器進行處理,，但要注意保持低溫,，以防RNA降解)；
室溫裂解5-10min,。
2.氯仿抽提
每1ml Trizol中加入200ul的氯仿,，蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右，室溫孵育2-3min,。2-8℃,，12000g離心15min后溶液分為三層，從上到下依次為水相(RNA),、中間層及有機相(DNA,、蛋白質等)，轉移水相至新的EP管中(注：此步一定要小心謹慎,，慢慢吸取,，不可觸及中間層，以免RNA被污染),。
3.異丙醇沉淀
每1ml Trizol中加入500ul異丙醇,，上下顛倒混勻后，室溫孵育10min,，2-8℃,，12000g離心10min，得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注：異丙醇最好提前預冷,，維持低溫環(huán)境,，以防RNA被降解)。
4.乙醇洗滌
棄去上清,，加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀,，2-8℃，7500g離心5min(注：75%乙醇可以用無水乙醇及無酶水來配制,，同樣最好預冷處理,；清洗時動作要輕柔,，過于劇烈會導致RNA沉淀散開，再次離心未免會重聚,，從而造成RNA的損失),。
5.溶解
棄去上清，于通風櫥內干燥RNA沉淀5-10min,，用50ul左右的無酶水重懸沉淀,，即可得到RNA溶液(注：干燥時間不可過長，太過干燥會導致沉淀很難溶解,，部分溶解的RNA的260/280的比值會大大降低,，甚至低于1.6；亦可采用金屬浴60℃,，5min以助溶),。
6.RNA質量的檢測
1)微量分光光度計
純RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小,，則代表可能有蛋白或有機溶劑的污染,，比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。
2)瓊脂糖凝膠電泳
可見三條帶,，從上往下一般為28s RNA,、18s RNA及5s RNA，一般情況下5s的帶非常淡,，甚至看不清,，28s帶的亮度應為18s帶亮度的2倍，且不存在拖尾,，即可證明RNA純度可以,，如若5s很明顯，而28s 與18s帶的亮度并無太大差別,，甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解,。
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