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Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)
Trizol是一種酸性試劑,，能從細(xì)胞和組織中快速分離RNA,，其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚,。裂解細(xì)胞后,，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性,，有利于保護(hù)RNA的完整性,；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機(jī)相,，RNA存在于上層水相中,，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機(jī)相中，從而達(dá)到分離的目的,。簡(jiǎn)單來(lái)講就是裂解細(xì)胞使RNA得以釋放,，加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離,，并進(jìn)一步純化得到RNA的過(guò)程,。那么你知道Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)是什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧,！
1.樣品的制備
1)細(xì)胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細(xì)胞的比例加入Trizol試劑(注：一般來(lái)講待細(xì)胞在六孔板上生長(zhǎng)至80%左右時(shí),，每孔收集的細(xì)胞加1ml Trizol即可)；
2)組織：按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理,，以利于RNA的釋放(注：組織可以先用液氮急凍后研磨處理,，也可用勻漿器或者組織研磨器進(jìn)行處理,，但要注意保持低溫，以防RNA降解),；
室溫裂解5-10min,。
2.氯仿抽提
每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右,，室溫孵育2-3min,。2-8℃，12000g離心15min后溶液分為三層,，從上到下依次為水相(RNA),、中間層及有機(jī)相(DNA、蛋白質(zhì)等),，轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中(注：此步一定要小心謹(jǐn)慎,，慢慢吸取，不可觸及中間層,，以免RNA被污染),。
3.異丙醇沉淀
每1ml Trizol中加入500ul異丙醇，上下顛倒混勻后,，室溫孵育10min,，2-8℃，12000g離心10min,，得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注：異丙醇最好提前預(yù)冷,，維持低溫環(huán)境，以防RNA被降解),。
4.乙醇洗滌
棄去上清,，加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀，2-8℃,，7500g離心5min(注：75%乙醇可以用無(wú)水乙醇及無(wú)酶水來(lái)配制，同樣最好預(yù)冷處理,；清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔,，過(guò)于劇烈會(huì)導(dǎo)致RNA沉淀散開(kāi)，再次離心未免會(huì)重聚,，從而造成RNA的損失),。
5.溶解
棄去上清，于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min,，用50ul左右的無(wú)酶水重懸沉淀,，即可得到RNA溶液(注：干燥時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，太過(guò)干燥會(huì)導(dǎo)致沉淀很難溶解,，部分溶解的RNA的260/280的比值會(huì)大大降低,，甚至低于1.6,；亦可采用金屬浴60℃，5min以助溶),。
6.RNA質(zhì)量的檢測(cè)
1)微量分光光度計(jì)
純RNA的260/280比值在2.0左右,，若比值偏小，則代表可能有蛋白或有機(jī)溶劑的污染,，比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解,。
2)瓊脂糖凝膠電泳
可見(jiàn)三條帶，從上往下一般為28s RNA,、18s RNA及5s RNA,，一般情況下5s的帶非常淡，甚至看不清,，28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍,，且不存在拖尾，即可證明RNA純度可以,，如若5s很明顯,，而28s 與18s帶的亮度并無(wú)太大差別，甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解,。
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