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問題解析:熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線

來源:本生(天津)健康科技有限公司   2024年02月29日 10:39  

  問題解析:熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線


  熒光定量 PCR反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)這個問題的常見原因,,主要可以歸結(jié)為以下幾種:

  反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠:一般建議設(shè)置循環(huán)數(shù)為 40。

  程序中未設(shè)置信號采集步驟:注意,兩步法擴增程序一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段;三步法擴增程序應(yīng)當(dāng)將信號采集設(shè)置在 72 度延伸階段,。

  引物降解:長時間未使用的引物應(yīng)先通過 PAGE 電泳檢測完整性,以排除引物降解的可能性,。

  模板濃度太低:這個大家減少稀釋度重復(fù)實驗就可以了,,一般來說,未知濃度的樣品先從最高濃度做起,。

  模板降解:無解,,請重新制備模板,可以重復(fù)實驗,。

  溶解曲線形狀異常

  (1)雜峰在主峰之前,,Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體


656.png


  這種情況主要有三個解決方法:

  重新設(shè)計引物;

  雜峰為引物二聚體,熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內(nèi)引物與引物糾纏比引物與模板結(jié)合更容易導(dǎo)致的,,可以嘗試提高模板濃度,、退火溫度或者降低引物濃度來進行改善;

  另外,當(dāng)目的基因表達量極低時,,染料法容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實驗結(jié)果,,此時,建議使用探針法定量,。

  (2)雜峰在主峰之后,,非引物二聚體

  上圖這種情況就是非特異性擴增,可能是引物特異性不好引起的,,也可能是空氣中有氣溶膠污染所導(dǎo)致,。

  大家可以先增加退火溫度再試試看,如果沒有改善,,那么就需要重新更換引物啦,。

  為了避免這種麻煩,BUNSEN本生小編建議大家在進行熒光定量 PCR實驗之前,,就對自己的引物做一個特異性驗證,。另外,每次試驗的 NTC(no template control)是一定要做的,。

  (3)只有引物二聚體,,無目的條帶

  如果擴增片段過短(小于 80bp),那么僅通過融解曲線就很難區(qū)分引物二聚/目的條帶,。

  另外,,也有可能是 熒光定量 PCR 擴增效率低或者沒有擴增,體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了,。

  總之,,產(chǎn)物長度建議大家還是設(shè)置在 100 - 200 bp,不要太短了。

  注:以上資料僅供參考!

  熒光定量PCR 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,,追求企業(yè)競爭力的不斷提升,。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀守法,嚴于律己,,寬仁以待,,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護和拓展市場,,較大限度的滿足客戶的需求,。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo),。本生!您信任的合作伙伴,。我們愿與您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來,。

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