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定量測定DNA-蛋白相互作用的新技術
麻省理工學院的研究人員利用新一代測序儀，開發(fā)出一種名為HiTS-FLIP的新技術,，能以的深度對DNA-蛋白的結合親和力進行定量測定,。
新一代測序技術自問世以來，為生物學帶來了深刻的變化,。它極大地推動了非模式物種的全基因組測序工作,，越來越多的物種基因組信息相繼公布。同時,，通過基因組重測序,，人們可以了解到單核苷酸多態(tài)性、突變熱點,、基因組結構變異,、群體多態(tài)性等重要信息。此外,，新一代測序還廣泛應用在宏基因組,、轉錄組和表觀基因組研究。然而，它的應用可不可以再廣一些呢,？
麻省理工學院（MIT）的Christopher Burge及其同事也在思考這一問題,。幾年前，MIT購入了Illumina的測序儀,。該儀器有著很好的微流體學和的照明及成像系統,。于是，他們打算用它來試著研究DNA與蛋白質的相互作用,。
他們的想法是,，將熒光標記的蛋白直接放入流動槽。如果這種熒光標簽與測序所使用的一種熒光dNTP匹配,，那么你可以讓儀器對它成像,，就好像對另一個堿基成像，你也可以看到蛋白所結合的DNA簇,，并根據信號強度判斷結合有多強,。他們開發(fā)出的這種技術稱為高通量測序-熒光配體相互作用圖譜分析（HiTS-FLIP）。
研究小組將HiTS-FLIP技術應用到酵母轉錄激活因子Gcn4上,。首先,，研究人員制備了一個隨機25聚體的DNA文庫，將其放入儀器,，并開展測序步驟,。之后他們通過變性，剝離了非天然鏈,，利用新的引物和Klenow合成了新的DNA,。他們再加入與單體（m）Orange結合的GCN4，并對結合的蛋白成像,。zui后,，他們在簇測序圖像上疊加了蛋白結合熒光圖像。簇大小的強度校正讓他們能夠預測特定序列的內在親和力,。之后,，他們還與Illumina的研究小組合作，從數據中獲得了解離常數,。這是很多測定相互作用的方法無法實現的,。
除了能夠測定解離常數，此方法還有其他優(yōu)點,。由于流動槽表面的低背景,，成像前的洗滌步驟可限制在2分鐘。相比之下,，蛋白結合芯片需要20分鐘的洗滌步驟,，才能去除許多弱的結合相互作用,。
同時，測量深度也有很大提高,。在25聚體的背景下,，他們獲得了每個7聚體的蛋白結合親和力的10萬次測定以及每個12聚體的500次測定。它所實現的分析深度能夠讓研究人員了解不同位置上殘基之間的復雜相互依存關系,。通過捕獲弱及復雜的相互作用,，該數據有助于GCN4結合的預測，并揭示出有著不同表達動力學的GCN4調控啟動子,。
這些數據顯示motif位置之間存在復雜的相互依存,，能夠更好地區(qū)分體內Gcn4p結合位點和調控靶點，并顯示與Gcn4p有著不同的啟動子親和力的基因有著不同的功能和表達動力學,。
www.biomart.cn/runwell/index.htm
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