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定量測(cè)定DNA-蛋白相互作用的新技術(shù)
定量測(cè)定DNA-蛋白相互作用的新技術(shù)
麻省理工學(xué)院的研究人員利用新一代測(cè)序儀,，開發(fā)出一種名為HiTS-FLIP的新技術(shù)，能以的深度對(duì)DNA-蛋白的結(jié)合親和力進(jìn)行定量測(cè)定,。
新一代測(cè)序技術(shù)自問世以來,，為生物學(xué)帶來了深刻的變化,。它極大地推動(dòng)了非模式物種的全基因組測(cè)序工作，越來越多的物種基因組信息相繼公布,。同時(shí),，通過基因組重測(cè)序，人們可以了解到單核苷酸多態(tài)性,、突變熱點(diǎn),、基因組結(jié)構(gòu)變異、群體多態(tài)性等重要信息,。此外,，新一代測(cè)序還廣泛應(yīng)用在宏基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組研究,。然而,，它的應(yīng)用可不可以再廣一些呢,？
麻省理工學(xué)院（MIT）的Christopher Burge及其同事也在思考這一問題。幾年前,，MIT購入了Illumina的測(cè)序儀,。該儀器有著很好的微流體學(xué)和的照明及成像系統(tǒng)。于是,，他們打算用它來試著研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用,。
他們的想法是，將熒光標(biāo)記的蛋白直接放入流動(dòng)槽,。如果這種熒光標(biāo)簽與測(cè)序所使用的一種熒光dNTP匹配,，那么你可以讓儀器對(duì)它成像，就好像對(duì)另一個(gè)堿基成像,，你也可以看到蛋白所結(jié)合的DNA簇,，并根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度判斷結(jié)合有多強(qiáng)。他們開發(fā)出的這種技術(shù)稱為高通量測(cè)序-熒光配體相互作用圖譜分析（HiTS-FLIP）,。
研究小組將HiTS-FLIP技術(shù)應(yīng)用到酵母轉(zhuǎn)錄激活因子Gcn4上,。首先，研究人員制備了一個(gè)隨機(jī)25聚體的DNA文庫,，將其放入儀器,，并開展測(cè)序步驟。之后他們通過變性,，剝離了非天然鏈,，利用新的引物和Klenow合成了新的DNA。他們?cè)偌尤肱c單體（m）Orange結(jié)合的GCN4,，并對(duì)結(jié)合的蛋白成像,。zui后，他們?cè)诖販y(cè)序圖像上疊加了蛋白結(jié)合熒光圖像,。簇大小的強(qiáng)度校正讓他們能夠預(yù)測(cè)特定序列的內(nèi)在親和力,。之后，他們還與Illumina的研究小組合作,，從數(shù)據(jù)中獲得了解離常數(shù)。這是很多測(cè)定相互作用的方法無法實(shí)現(xiàn)的,。
除了能夠測(cè)定解離常數(shù),，此方法還有其他優(yōu)點(diǎn)。由于流動(dòng)槽表面的低背景,，成像前的洗滌步驟可限制在2分鐘,。相比之下，蛋白結(jié)合芯片需要20分鐘的洗滌步驟,，才能去除許多弱的結(jié)合相互作用,。
同時(shí),，測(cè)量深度也有很大提高。在25聚體的背景下,，他們獲得了每個(gè)7聚體的蛋白結(jié)合親和力的10萬次測(cè)定以及每個(gè)12聚體的500次測(cè)定,。它所實(shí)現(xiàn)的分析深度能夠讓研究人員了解不同位置上殘基之間的復(fù)雜相互依存關(guān)系。通過捕獲弱及復(fù)雜的相互作用,，該數(shù)據(jù)有助于GCN4結(jié)合的預(yù)測(cè),，并揭示出有著不同表達(dá)動(dòng)力學(xué)的GCN4調(diào)控啟動(dòng)子。
這些數(shù)據(jù)顯示motif位置之間存在復(fù)雜的相互依存,，能夠更好地區(qū)分體內(nèi)Gcn4p結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控靶點(diǎn),，并顯示與Gcn4p有著不同的啟動(dòng)子親和力的基因有著不同的功能和表達(dá)動(dòng)力學(xué)。
www.biomart.cn/runwell/index.htm
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