無細(xì)胞冷凍干燥可穿戴技術(shù)（wFDCF）

來自哈佛大學(xué)Wyss生物啟發(fā)工程研究所和麻省理工學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種基于 CRISPR 技術(shù)的可穿戴的合成生物學(xué)傳生物感器，在無需引入活工程細(xì)菌的情況下,，只需簡單的水溶液暴露,，即可激活該生物傳感器（wearable freeze-dried, cell-free, wFDCF），從而用以檢測環(huán)境中的病原體和毒素,，并發(fā)出熒光信號報(bào)告,。更棒的是，研究團(tuán)隊(duì)還將這一技術(shù)集成到了標(biāo)準(zhǔn)口罩中,，以檢測患者呼吸中,，以及空氣中是否存在 SARS-CoV-2 病毒，該技術(shù)的檢測限可以與目前的實(shí)驗(yàn)室方法（例如 qPCR）相媲美,。

在這項(xiàng)研究種,，Agilent BioTek 的 SynergyNEO HTS 多功能酶標(biāo)儀主要用于適配 wFDCF 傳感器的紡織物材料的高通量篩選，以及驗(yàn)證基于 CRISPR 的 wFDCF 傳感器用于 RNA 直接檢測的有效性這兩方面,。

研究團(tuán)隊(duì)最初設(shè)計(jì)了一種基于比色法信號輸出的 wFDCF 傳感器,，由三層皮膚安全材料制成的有機(jī)硅彈性體逐層組裝而成，F(xiàn)DCF 反應(yīng)傳感器嵌入其中,，組裝好的傳感器具有合適的彈性和柔韌性以支持可穿戴設(shè)計(jì),。液態(tài)樣本在最上層的入口進(jìn)入后通過毛細(xì)管作用快速進(jìn)入反應(yīng)室。合成生物學(xué)的電路傳感器輸出采用 LacZ β-半乳糖苷酶操縱子,，其能夠水解氯酚紅-β-d-半乳糖苷（CPRG）,，當(dāng)暴露于靶標(biāo)后會發(fā)生黃到紫色的變化。通過這樣的巧妙設(shè)計(jì),，研究團(tuán)隊(duì)測試了不同的傳感器模型,，用于檢測小分子或病毒 RNA（圖 1）。

圖 1：比色法信號輸出的 wFDCF 傳感器設(shè)計(jì)示意圖

隨后,，研究團(tuán)隊(duì)深入繼續(xù)深入該傳感器的檢測靈敏度和適用范圍,，將其應(yīng)用于日常穿戴的紡織物中，并開發(fā)基于熒光檢測信號輸出的檢測體系,，此項(xiàng)工作的第一步,，便是篩選出更加適合的 FDCF 傳感器紡織品載體。

動力學(xué)顯色反應(yīng)結(jié)束后在微孔板中可觀察到明顯的顯色反應(yīng)變化，SynergyNEO 和 Gen5 軟件能夠自動生成每個樣本的動力學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)果,，用戶后續(xù)的參數(shù)統(tǒng)計(jì)和分析（圖 2）,。通過 OD420 峰值吸收光強(qiáng)度、動力學(xué)平均反應(yīng)速率,、到達(dá)最大信號時間、滯后時間（LagTime）等動力學(xué)參數(shù)聯(lián)合紡織物密度和自發(fā)熒光等參數(shù),，設(shè)計(jì)了篩選評分,，最后研究團(tuán)隊(duì)選擇了使用 85% 的聚酯纖維和 15% 的聚酰胺纖維的織物用于后續(xù)的熒光和發(fā)光信號輸出傳感器的載體（圖 3）。

圖 2：SynergyNEO 用于篩選 FDCF 適配的紡織物結(jié)果

圖 3：wFDCF 比色紡織品篩選的歸一化功能評分結(jié)果

CRISPR 技術(shù)用于基因編輯領(lǐng)域已經(jīng)是非常成熟和熱門的技術(shù),，除了基因編輯,，這項(xiàng)技術(shù)在分子檢測領(lǐng)域也是大放異彩，早在 COVID-19 爆發(fā)不久,，CRISPR 領(lǐng)域大神華人科學(xué)家張鋒于 2020 年發(fā)表了使用 CRISPR 診斷工具檢測新型冠狀病毒 COVID-19 的 SHERLOCK 技術(shù),，詳細(xì)介紹了標(biāo)本提取和檢測的方案。隨后,，馬薩諸塞州劍橋市的夏洛克生物科學(xué)公司（Sherlock Biosciences）獲得了美國食品和藥物管理局 (FDA) 的緊急使用授權(quán) (EUA),，用于檢測導(dǎo)致 COVID-19 的病毒的 SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 試劑盒，這是 FDA 首次授權(quán)使用 CRISPR 技術(shù),。安捷倫的 BioTek SynergyNeo2 是當(dāng)時市場上唯一被批準(zhǔn)用于 SHERLOCK SARS-CoV-2 診斷測試的微孔板讀板機(jī),。

由于 SHERLOCK 技術(shù)具有靈敏度高，響應(yīng)速度快,、單堿基對分辨率,、凍干兼容性和面向任意 DNA/RNA 序列的可編程性等諸多優(yōu)點(diǎn)，該研究團(tuán)隊(duì)將此技術(shù)融入到 wFDCF 的設(shè)計(jì)中,，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種可以檢測呼出氣溶膠中 SARS-CoV-2 的口罩,，只需按下病毒外側(cè)的按鈕，啟動傳感器內(nèi)三種不同的生物反應(yīng),，第一種反應(yīng)用于破壞新冠病毒的蛋白外殼，暴露其內(nèi)部的 RNA,；第二個反應(yīng)是一個常溫 PCR 擴(kuò)增步驟,，特異性擴(kuò)增新冠病毒的刺突蛋白 （S 蛋白） 的基因片段,；最后第三個反應(yīng)使用基于 CRISPR-Cas13a 的 SHERLOCK 技術(shù)來檢測病毒的 S 基因,，被激活的 Cas13a 將熒光-DNA 探針分子切成兩個更小的片段,，在口罩內(nèi)部的 LAF 窗口會顯示出肉眼可見的條帶（圖 4）。

除此之外,，研究團(tuán)隊(duì)還繼續(xù)開發(fā)了光纖網(wǎng)絡(luò)集成的 wFCDF 傳感器，能夠產(chǎn)生更客觀可靠的熒光數(shù)據(jù)信號,，可以通過智能手機(jī)的 APP 實(shí)時查看該信號,。

圖 4：口罩式用于檢測 SARS-Cov-2 的集成化可穿戴設(shè)備設(shè)計(jì)

為了驗(yàn)證這種融合了 SHERLOCK 技術(shù)的 wFDCF 的有效性,，使用 SynergyNEO 測試了 CRISPR-Cas13a 系統(tǒng)直接檢測病毒 RNA 的效果。

對可穿戴設(shè)備的熒光顯色成像結(jié)果的信號強(qiáng)度做均一化處理后,，其動力學(xué)曲線（圖 5 綠色曲線）和微孔板熒光強(qiáng)度曲線（圖 5 紅色曲線）一致，此結(jié)果提示基于此 Cas13a 酶體系的 wFCDF 傳感器的可穿戴設(shè)備平臺具有良好的病毒 RNA 檢測效果,，除此,。

圖 5：wFDCF CRISPR-Cas13a 生物傳感器直接檢測 RNA 的效果驗(yàn)證

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