基于需要遞轉不同種類核酸/蛋白類型研究,，在細胞轉染環(huán)節(jié),，研究者們常碰到如下三類問題：

1. 細胞對化學試劑較為敏感，轉染后,，細胞活率下降或死亡,；

2. 研究常用細胞類型較多,，不同類型細胞,，轉染效率差異較大，導致單個轉染試劑或者實驗流程,，無法滿足實驗需求,；

3. 遞轉多種類型核酸或蛋白，需要挑選對應的轉染試劑,，并且需要大量實驗優(yōu)化,，才可以得到較高的轉染效率。

有沒有一款化學轉染試劑,，可以同時應對常規(guī)到難轉染的細胞類型,，有著較低的細胞毒性,，并且適用于多種核酸/蛋白類型遞轉呢,？兼具多重功能、高性能的TransIT-X2®轉染試劑,，可同時應對常見細胞及難轉染細胞類型,，避免條件摸索和大量的重復性實驗，輕松得到您理想的實驗結果,。

• 已驗證在大多數(shù)細胞類型中（如貼壁/懸浮細胞,、原代細胞、神經細胞等）,，都有著優(yōu)異的轉染效率,、低毒性（特別相對于形成脂質體復合物的Lipofectamine®系列試劑）、高性能的表現(xiàn),；

• 適用于多種研究領域,，包括但不限于干細胞研究、基因編輯CRISPR研究,、RNAi基因干擾/沉默,、穩(wěn)轉細胞株構建、低毒性的轉染實驗,、共轉染實驗等,；

• 允許高效且穩(wěn)定的同時遞轉多種核酸/蛋白類型，包括但不限于質粒 DNA,、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分,。

為什么Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System有著如此高性能及廣泛適應性呢？這歸因于Mirus強大且高效的遞轉平臺設計,，可進行多重,、多功能組合的轉染試劑組分篩選并優(yōu)化。成立于1995年的Mirus，專注及深耕核酸遞轉領域多年（圖1）,，從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別,、可用于AAV和LV生產的TransIT-VirusGEN®，都是基于該遞轉平臺進行設計及開發(fā)的,。截至目前,，使用Mirus產品發(fā)表文章已超過1萬篇，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫涵蓋了超過1200種細胞類型,，更多文章及數(shù)據(jù)查詢,，請點擊這里。

圖1 Mirus產品年鑒

不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉染試劑（如陽離子聚合物或陽離子脂質體）,，為了進一步提高轉染效率,，以應對不同細胞類型或特定的應用。Mirus將多聚物(Polymer)及脂質(Lipids)技術進行多重組合,，在不形成脂質體復合物（即liposome,，通常具有細胞毒性）前提條件下，得到多種類,、高性能的轉染方案,，克服細胞遞轉過程中的多重阻礙，以實現(xiàn)更高效轉染和更低的細胞毒性（圖2）,。

圖2 Mirus轉染試劑原理示意圖

基于上述Mirus強大,、高效的遞轉平臺設計，在進行多重,、多組合篩選,、優(yōu)化及后續(xù)驗證，智能迭代設計流程,，優(yōu)化轉染技術中的每個組分（圖3）,。Mirus推出一系列經典轉染試劑，以應對多種需求：

1. 廣譜,、高性能,、低毒性的轉染試劑家族: TransIT-X2®、TransIT®-LT1,、TransIT®-2020

2. 針對特定細胞類型的轉染試劑家族：TransIT®-293,、TransIT®-BrCa、TransIT®-CHO,、TransIT-HeLaMONSTER®,、TransIT®-Insect、TransIT®-Jurkat,、TransIT®-Keratinocyte

3. 針對特定應用的轉染試劑家族：

-      病毒生產：VirusGEN® 轉染試劑及配套試劑盒,、TransIT®-Lenti

-      蛋白/抗體生產：TransIT-PRO®,、CHOgro® Expression System、CHOgro® High Yield Expression System

4. 寡核苷酸遞轉的轉染家族：TransIT®-Oligo,、TransIT-siQUEST®,、TransIT-TKO®

5. mRNA及長鏈RNA遞轉：TransIT®-mRNA

圖3 Mirus智能迭代設計，轉染試劑優(yōu)化流程示意圖

Mirus TransIT-X2®轉染試劑性能數(shù)據(jù)展示

Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉表達EGFP質粒DNA分別至A549,、CHO-K1,、Hep G2、MDCK,、LNCaP,、PC-12、原代人乳腺上皮細胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細胞(NHDF)細胞中,。實驗使用96孔板,， TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4µl，DNA加入量為0.1µg(使用試劑:DNA=2:1,、3:1或4:1),。轉染后48小時，使用Guava® easyCyte™ 5HT流式細胞儀重復檢測三次,，評估轉染效率,。

圖4 TransIT-X2®在包括原代細胞在內的多種細胞類型中都具有較高轉染效率

使用TransIT-X2®(Mirus Bio)、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉染熒光素酶編碼質粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細胞中,，轉染24小時，通過熒光素酶活性評估轉染效率,，定量受損細胞中釋放的LDH評估細胞毒性,。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細胞相比，在最佳試劑:DNA比例下,，Trans - x2®有著更高的熒光強度及更低的細胞毒性,。

圖5 相較于使用單一組分且形成陽離子脂質體復合物(liposome)的Lipofectamine®系列轉染試劑，TransIT-X2®有著更高的轉染效率及更低細胞毒性

實驗Tips: 針對更多特定細胞類型,，試劑使用建議,，詳細請見：Cell-type specific transfection protocol recommendations (PDF).

Mirus TransIT-X2®在RNAi干擾實驗中性能數(shù)據(jù)展示

基因沉默相關功能研究在分子和細胞生物學中發(fā)揮著重要作用，化學轉染也在該研究領域扮演者重要角色,。常見參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括：

-      小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產生的短雙鏈 RNA(20-25bp),；

-      微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非編碼 RNA 處理后所產生的一類短的、單鏈 RNA(20-22nt),。

利用 RNAi 抑制基因表達的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA),，這些短 RNA 序列可通過病毒或非病毒載體方式進行表達，更多詳細信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing,。

圖6  不同RNAi干擾途徑示意圖

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉染試劑用于轉染siRNA(靶點為內源性蛋白質- GAPDH和AHA1),，對照使用正常人類真皮成纖維細胞(NHDF)遞轉非靶向siRNA,。Trans IT-X2®加入量為4µl， Lipofectamine®2000加入量為6µl,，siRNA加入量都為25 nM,。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平測量GAPDH或AHA1 mRNA進行檢測，轉染后48小時均一化至非靶向對照組的mRNA水平,，誤差則為三次復孔實驗的標準差,。

圖7  基于siRNA核酸遞轉類型的基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000,，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉染試劑用于轉染Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana™ miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗證,，可降低PTK9 mRNA表達水平)。Pre-miR™陰性質控用于評估mRNA表達水平基線值,。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3µl,， 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平,，經過陰性質控的均一化,，得到PTK9 mRNA表達水平值。

圖8  基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究,，相比Lipofectamine® 2000,，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

Mirus TransIT-X2®在CRISPR基因編輯實驗中性能數(shù)據(jù)展示

經過改造及優(yōu)化的細菌 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，已被廣泛應用到哺乳細胞的基因編輯中,?；?/span>CRISPR基因編輯實驗常見兩組分：Cas9蛋白及引導RNA(gRNA)。當Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA,，會觸發(fā)兩種內源性修復機制,，即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(HDR)，以應對細胞中產生的DNA斷裂,?；?/span>NHEJ細胞修復通路，為非精準,、且容易出錯細胞修復通路,，可引入導致基因功能缺失的Indel?；?/span>HDR的細胞修復通路,，則需要額外的同源 DNA 作為修復模板，從而實現(xiàn)“精準”修復,，在目的基因插入特定的基因或長片段序列,。

根據(jù)研究者們不同的實驗需求，CRISPR基因編輯可以有多種類型實驗設置,，這意味需要面對不同核酸類型的轉染甚至共轉染,，舉例如下：

1.      質粒pDNA轉染

作為CRIPSR實驗關鍵兩組分：Cas9蛋白及gRNA,，可以設計單個質粒DNA，共同表達兩組分(A),；或者使用兩質粒系統(tǒng),，其中一個質粒表達Cas9蛋白，另外一個質粒表達gRNA(B),；當使用Cas9切口酶(Nickase),，則需要兩條gRNA，這時可能需要三質粒系統(tǒng)的遞轉實驗,。

2.      質粒DNA及RNA寡核苷酸共轉染

此時,，與上述實驗設計不同的是，gRNA以寡核苷酸形式進行遞轉,，這就意味著遞轉實驗需要同時轉染質粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B),。

3.      mRNA及RNA寡核苷酸共轉染

為了避免由于質粒DNA基因組整合而導致的脫靶效應，可以共轉染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸),。

4.      Cas9/gRNA RNP復合物遞轉

隨著Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟,，越來越多的研究者們選擇直接從第三方購買高保真Cas9蛋白，以及有著額外化學修飾且在細胞內更穩(wěn)定的gRNA寡核苷酸,。除了極大的縮短和簡化CRISPR實驗流程外,，相對于質粒或者mRNA方式合成,，直接遞轉RNP復合物的方式有著更高的特異性及編輯效率,。

實驗Tips: 針對上述不同CRISPR實驗設計及遞轉情形，TransIT-X2® Dynamic Delivery System經優(yōu)化的具體實驗說明,， 下載鏈接如下：

TransIT-X2® for CRISPR Plasmid + gRNA Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP + ssODN Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP Delivery (PDF)

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System  (2 µl/孔,，24孔板, Mirus Bio)共轉染0.5 µg質粒DNA(表達Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細胞中，轉染后48小時,，T7E1驗證切割效率。

圖9 質粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉染：TransIT-X2®分別在293T/17,、U2OS和NHDF細胞中共轉Cas9質粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸),，都有著較高的基因編輯效率(18-48%)

2-part gRNA (PPIB基因，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復合體,，分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 µl/孔,， Mirus Bio)、Lipofectamine® CRISPRMAX™ (1.5 µl/孔,， ThermoFisher) ,、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 µl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® 3000 (1.5 µl/孔ThermoFisher) 遞轉至293T/17及U2OS細胞中,。測試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM),，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM),，轉染后48小時，T7E1驗證切割效率,。

圖10 Cas9/gRNA RNP復合體遞轉：相較于Lipofectamine®系列轉染試劑,，TransIT-X2®有著更高的切割效率

Mirus TransIT-X2®產品優(yōu)勢

?新型基于多組分開發(fā)的廣譜型轉染試劑(適用于多種細胞，包括難轉細胞),；

? 可同時轉染核酸及蛋白,，包括不限于DNA，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復合物,；

?不形成脂質體復合物,，降低細胞毒性；

? 滿足多種應用：基因過表達,、基因沉默,、基因編輯、干細胞研究,、穩(wěn)轉細胞株構建等,。

相關產品信息

文末福利：

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美國Mirus公司成立于1995年,，是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉染試劑的公司,，同時也是目前該類試劑主要的供應商之一,。Mirus其許多杰出成果獲得廣大用戶的好評。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理,，始終秉承著專業(yè),、嚴謹?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質的產品與服務。