emfret成立于2002年，emfret公司專注心血管和血液系統(tǒng)研究用抗體研發(fā)和生產(chǎn),，emfret公司的抗體不僅適用于流式分析,、WB檢測(cè)，還可用于免疫組化/免疫熒光及免疫共沉淀檢測(cè),。

產(chǎn)品列表

抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)Protocols

一,、小鼠血小板表面糖蛋白的流式細(xì)胞術(shù)分析

緩沖液和試劑準(zhǔn)備：

Tris緩沖鹽水/肝素（TBS/Hep）：20 mM Tris/HCl；137 mM NaCl,；pH 7.3,；含有20 U/ml肝素。

磷酸鹽緩沖液（PBS）：137 mM NaCl,；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄,；8 mM Na₂HPO₄,；pH 7.14,。

改良臺(tái)氏液/改良Tyrode''s溶液：134 mM NaCl,；0.34 mM Na₂HPO₄；2.9 mM KCl,；12 mM NaHCO₃,；20 mM Hepes,；pH 7.0；5 mM葡萄糖,；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。

腺苷三磷酸雙磷酶Apyrase：溶于水（10 U/mL）,，在-20°C下儲(chǔ)存,。

前列環(huán)素Prostaglandin（Prostaglandin 2, PGI2）：溶于水（1 mM）,，在-20°C下儲(chǔ)存,。

CaCl₂：1 M溶于水。

稀釋或洗滌全血的制備：

1,、用肝素化玻璃毛細(xì)管（如環(huán)帽）從眶后神經(jīng)叢抽取50 µL血液,，放入1.5 ml含有200 µL Tris緩沖鹽水/肝素（20 U/ml）的試管中。

2,、在1 mL Tyrode緩沖液中稀釋,，用于流式細(xì)胞儀分析,。

3,、為了制備洗滌過(guò)的血液，將稀釋的血液以900 x g離心5分鐘,，去除上清液,，并將沉淀重懸在1.25 mL Tyrode緩沖液中。

4,、在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前直接加入1 mM CaCl₂,。

注：對(duì)于凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化,，必須去除血漿以防止抗凝血酶活性,。

血小板制備：

1,、制備洗滌過(guò)的血小板是一種更耗時(shí)的方法,，需要大量的血液,，但產(chǎn)生的血小板制劑可以使用數(shù)小時(shí)。

2,、用1.5 cm玻璃毛細(xì)管從眶后叢收集0.5-1 mL血液,，放入含有200 µL TBS/肝素（20 U/ml）的1.5 mL管中。去除含有一些紅細(xì)胞的上清,。

3,、以500 x g離心樣品5分鐘,，并將富含血小板的血漿（PRP）轉(zhuǎn)移到新的試管中,。

4,、將血小板懸浮液以300 x g離心8分鐘,，并將不含任何紅細(xì)胞的PRP轉(zhuǎn)移到新的試管中。

5,、加入0.5 µM前列環(huán)素（PGI2）,，以1300 x g離心5分鐘,。

6,、將血小板顆粒重新懸浮在1 mL Tyrode緩沖液中,，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙磷酶和0.5 µM前列環(huán)素,，在37℃下孵育5分鐘,，并在1300 x g下離心5分鐘。

7,、重復(fù)步驟5,，將血小板顆粒重懸于0.5 ml Tyrode緩沖液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙磷酶,，并在37℃下孵育30分鐘,。

血小板表面糖蛋白的單色分析：

1,、將5 µL特異性或陰性對(duì)照抗體和25 µL稀釋的全血在分析管中混合,，渦旋混勻1-2秒,。

2,、在室溫下孵育15分鐘,。

3,、加入400 µL PBS停止反應(yīng),，并在30分鐘內(nèi)進(jìn)行分析,。

如所述,，將樣品與FITC綴合的對(duì)照IgG（黑線）,、GPVI抗體或GPV抗體孵育,。血小板通過(guò)前向散射（FSC）/側(cè)散射（SSC）血小板通過(guò)前向（FSC）/側(cè)向（SSC）散射特征進(jìn)行篩選。在單獨(dú)的直方圖中顯示了被篩選（R1）的血小板的熒光（FL1）強(qiáng)度,。RBC：紅細(xì)胞,。

血小板活化的雙色分析：

1,、將5 µL特異性或陰性對(duì)照抗體與5 µL泛血小板標(biāo)記物一起加入測(cè)定管中,。

2,、此時(shí),，加入小體積（<5 µL）的任何額外的試劑（如抑制劑）。

3,、加入26 µL稀釋的全血或經(jīng)洗滌過(guò)的血小板（100萬(wàn)）,，渦旋混勻1-2秒,。

在室溫下孵育15分鐘,。加入400 µL PBS停止反應(yīng),，并在30分鐘內(nèi)進(jìn)行分析,。

小鼠血小板分別與PBS或0.1 U/mL的凝血酶（thrombin）一起與FITC和PE結(jié)合的mAbs一起孵育,。通過(guò)GPIX或GPIIbIIIa（FL1; gate 1）的表達(dá)對(duì)血小板進(jìn)行了篩選,。

二,、免疫組織化學(xué)（用丙酮固定冷凍切片）

請(qǐng)注意：不建議在（對(duì)）甲醛固定的樣本上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，因?yàn)榇蠖鄶?shù)大鼠抗體在這些條件下對(duì)小鼠組織的效果很差,。

1,、將冷凍組織的切片放在玻片上,，并在4°C下的冰冷100%丙酮中固定20分鐘,。在室溫下干燥一整夜,。

2,、為了減少試劑的用量，在玻片上的組織切片周圍可以用防水筆畫一個(gè)疏水圈,。在所有后續(xù)的步驟中，這個(gè)圈起來(lái)的區(qū)域都不應(yīng)該干燥,。因此，建議在潮濕的盒子中進(jìn)行孵育步驟,。

3、在PBS中孵育玻片20分鐘,。

4、使用過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗時(shí),，將玻片在室溫下與0.03%的H₂O₂孵育10分鐘以抑制內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性,。在PBS中三次洗滌玻片,，每次5分鐘,。

5、用PBS稀釋（比例1:10或1:100）的封閉液（二抗體宿主物種的血清）,，室溫下孵育玻片1小時(shí),。

6,、一抗（2-10 µg/ml）室溫孵育2小時(shí),。

7,、吸取多余液體,，然后在PBS中洗滌三次,，每次5分鐘,。

8,、用熒光素或過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗（例如：親和純化的驢抗大鼠IgG-FITC或HRP）覆蓋玻片,，按照說(shuō)明書(shū)在封閉液中稀釋,，室溫下孵育1小時(shí)。

9,、吸取多余液體，PBS洗滌三次,，每次5分鐘。

10,、熒光染色的樣本可以直接通過(guò)熒光顯微鏡分析,。

11,、為了可視化過(guò)氧化物酶標(biāo)記的組織,，用新鮮制備的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物覆蓋玻片,，并在顯微鏡下可見(jiàn)紅色染色,，時(shí)間可在5至30分鐘之間變化。在橙色背景染色出現(xiàn)之前,，用去離子水沖洗停止反應(yīng)。用伊紅染色30-240秒,，然后在溫水中沖洗玻片20分鐘,。使用水溶性封裝溶液固定切片。

三,、免疫沉淀

緩沖液和試劑準(zhǔn)備：

PBS/EDTA：137 mM NaCl,、2.7 mM KCl、1.5 mM KH₂PO₄,、8.0 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O,，pH 7.3；5 mM EDTA,。

IP緩沖液：40 mM Tris/HCl、0.3 M NaCl,、1 mM EDTA、2 mM PMSF,、10 µg/mL Leupeptin蛋白酶抑制劑,、10 µg/mL Aprotinin抑肽酶,、1 µg/mL Pepstatin胃蛋白酶抑制劑,。

Igepal非離子表面活性劑：10%的H₂O溶液。

2x SDS樣品緩沖液：10% β-巰基乙醇（用于還原緩沖液）,、10% Tris緩沖液（1.25 M）,、20%甘油、4%SDS,、0.02%溴酚藍(lán)。

1,、將小鼠血小板或細(xì)胞在1 mL PBS/EDTA（5分鐘,，1300 x g）中洗滌3次，并使用IP緩沖液重懸,。

2、加入1% Igepal 在室溫下溶解血小板（15–20分鐘）,。

3,、10000 x g下離心5分鐘去除細(xì)胞碎片，并將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中。

4,、加入20 µL洗滌過(guò)的protein G agarose（PGA）,。在4°C下混勻孵育至少3小時(shí)。

5,、3000 x g離心樣品5分鐘,。將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，以說(shuō)明書(shū)中給定的濃度（通常在2-5 µg/mL之間）加入抗體，30分鐘后加入25 µL洗滌過(guò)的PGA,。在4°C下混勻孵育至少2小時(shí)，最好過(guò)夜,。

6,、將樣品在3000 x g下離心1分鐘,，向PGA中加入1 mL含有1% Igepal的1 x IP緩沖液,。在3000 x g下離心1分鐘,。

7,、用IP緩沖液中洗滌PGA兩次（3000 x g離心1分鐘）,。

8,、加入25 µL 1x SDS樣品緩沖液（還原或非還原）,，將PGA重懸,，煮沸5分鐘。9,、然后將樣品冷凍（-20°C）以備日后使用，或者進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析。

四,、免疫印跡分析（Western Blot Analysis）

緩沖液和試劑準(zhǔn)備：

裂解緩沖液：40mM Tris/HCl、0.3 M NaCl,、1 mM EDTA、0.05% NaN₃、1% Igepal,。

PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl,、1.5 mM KH₂PO₄、8.0 mM Na₂HPO₄ x 2H₂O,，pH 7.3。

5%脫脂牛奶-PBS：含5%脫脂奶粉的PBS,。

PBS/T：PBS含0.1%吐溫20,。

1%脫脂牛奶-PBS/T：含1%脫脂牛奶的PBS/T。

所有步驟都可在室溫下進(jìn)行：

1,、在裂解緩沖液中制備小鼠血小板或細(xì)胞的裂解物，并與（2x）SDS樣品緩沖液在95°C下孵育5分鐘,。

2,、根據(jù)說(shuō)明書(shū),，在還原或非還原條件下,，通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì),，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。

3,、用5%脫脂牛奶封閉膜1小時(shí)。

4,、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的一抗（2-5 µg/mL）,，孵育1小時(shí),。

5、用PBS/T沖洗膜兩次,，30分鐘。洗滌程序可以減少到三次,，每次10分鐘,。

6、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的二抗（HRP偶聯(lián)的抗大鼠Ig）,，孵育45-60分鐘,。

7、用PBS/T沖洗膜兩次,，30分鐘。

8,、使用ECL（化學(xué)發(fā)光）顯色。

下圖為emfret公司授權(quán)上海起發(fā)在中國(guó)區(qū)域的代理的授權(quán)書(shū),。

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