來自《2351 真菌毒素測定法-2020版藥典》

本法適用于藥材,、飲片及中藥制劑中黃曲霉毒素B1,、B2、G1,、G2,、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素,、玉米赤霉烯酮,、展青霉素、伏馬毒素B1,、B2及T-2毒素的測定,。

1、 儀器分析方法：

1-1  HPLC法（液相色譜法）,，采用柱后衍生法,，碘衍生法或光化學(xué)衍生法，測試黃曲霉毒素B1,、B2,、G1、G2,、赭曲霉毒素A,、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮共4類

1-2  LC-MS/MS法（液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法），測試全部種類及多種真菌毒素同時(shí)分析

1-3  ELISA法（酶聯(lián)免疫法）,，僅測試黃曲霉毒素類

2,、 前處理方法

2-1前處理方法（適用于HPLC法和LC-MS/MS法）

舉例（測試黃曲霉毒素）：取供試品粉末約15g（過二號篩），精密稱定,，置于均質(zhì)瓶中,，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml,，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11 000r/min）,，離心5分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液15ml,，置50ml量瓶中,，用水稀釋至刻度，搖勻,，離心10分鐘（離心速度4000r/min）,，精密量取上清液20ml，通過免疫親合柱,，流速每分鐘3ml,，用水20ml洗脫（必要時(shí)可以先用淋洗緩沖液10ml洗脫，再用水10ml洗脫）,，棄去洗脫液,，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子,，再用適量甲醇洗脫,，收集洗脫液，置2ml量瓶中,，加甲醇稀釋至刻度,，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過,，取續(xù)濾液,，即得。

前處理方法中,，一是稱樣量多達(dá)15-20g,，有些中藥材比較珍貴，成本較高,；

二是采用免疫親和法進(jìn)行前處理,，操作步驟復(fù)雜，柱子儲運(yùn)使用條件需要保持低溫,。

三是每種真菌毒素對應(yīng)一種免疫親和柱和一種儀器分析條件,，測試多種真菌毒素時(shí)，成本很高，而且效率較低,。

一般基于這三種原因,，實(shí)驗(yàn)員查找其他的前處理方法。

2-2 前處理方法（適用于ELISA法）

稱取供試品粉末約2.0g至50ml離心管中,，加入20ml甲醇,，振蕩5分鐘，室溫（20～25℃）下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心5分鐘,，取2ml上清液至10ml干凈離心管中,，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?/span>，加入2ml去離子水渦動30秒,，再加入6ml三LV甲烷振蕩2分鐘,，室溫下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取下層三LV甲烷液3ml至10ml離心管中,，置氮吹儀上于50～60℃水浴濃縮至干,，加入1ml正己烷渦旋30秒，再加入2ml磷酸鹽緩沖液渦旋1分鐘,，室溫下以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心5分鐘,，取下層液,，即得,。

前處理方法中，兩次濃縮轉(zhuǎn)溶操作,，容易影響結(jié)果平行性,，氮吹濃縮的效率相對低。

2-3前處理方法（適用于展青霉素,，LC-MS/MS分析）

供試品溶液的制備  取供試品粉末約4g（過二號篩）,，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中,，加水20ml和果膠酶（活性大于1500IU/g）75μl,，混勻，40℃下放置2小時(shí),，精密加入乙腈60ml,，高速攪拌2分鐘（攪拌速度大于11 000r/min），離心10分鐘（離心速度4000r/min）,，取上清液20ml,，加入無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4：1）混合粉末3g，充分振搖2分鐘,，離心10分鐘（離心速度4000r/min）,，取上清液8ml，通過展青霉素固相凈化柱，收集凈化液,，混勻,，精密量取5ml（相當(dāng)于0.3g樣品），置玻璃試管中,，40℃條件下用氮?dú)獯抵两?，?%乙腈溶液（用乙酸調(diào)節(jié)pH值至2）定容至0.5ml，渦旋2分鐘使混勻,，用微孔濾膜（0.22μm）濾過,，取續(xù)濾液，即得,。

前處理方法中加入酶,，并且在40℃下放置了2小時(shí)，采用展青霉素專用固相萃取柱做前處理,，此方法只做展青霉素,，比其他采用免疫親和柱凈化的前處理方法略微簡化。

2-4 前處理方法（適用于10種真菌毒素,，LC-MSMS分析）

測定藥材,、飲片及中藥制劑中的黃曲霉毒素B1、B2,、G1,、G2、赭曲霉毒素A,、嘔吐毒素,、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1,、B2及T-2毒素,。

取供試品粉末約5g（過二號篩），精密稱定,，精密加入70%甲醇溶液50ml,，超聲處理30分鐘，離心,，精密量取上清液10ml,，用水稀釋至20ml，搖勻,。精密量取3ml,，緩慢通過已經(jīng)處理好的HLB柱［規(guī)格：3ml(60mg)，依次用甲醇和水各3ml洗脫］,，直至有適量空氣通過,，收集洗脫液,；隨后用3ml甲醇洗脫，收集洗脫液,，合并兩次洗脫液,，于40℃氮?dú)饩徛抵两桑?0%乙腈溶液定容至1ml,，用微孔濾膜(0.22μm)濾過,，取續(xù)濾液，即得,。

前處理方法中采用了多功能固相萃取柱,，經(jīng)過活化平衡淋洗洗脫步驟后，上機(jī)到LC-MSMS分析,，“方法六適用于樣品中多種真菌毒素的篩查測定,，實(shí)際操作中如果遇到毒素有檢出，但樣品中監(jiān)測離子對峰面積比與對照品的監(jiān)測離子對峰面積比不一致時(shí),，建議選用其他監(jiān)測離子對重新進(jìn)樣確證或選用其他檢測方法進(jìn)行判定,。”

3、 小結(jié)

3-1 酶聯(lián)免疫法（ELIS法）僅測試黃曲霉毒素類,，其他的真菌毒素不在其中,；

3-2 HPLC法測試4類，每類真菌毒素對應(yīng)一種前處理方法和儀器分析方法,；

3-3 LC-MS/MS法可以單獨(dú)測試某種真菌毒素,，也可以一次進(jìn)樣檢測多種真菌毒素，分析結(jié)果用于篩查還是定量分析,，取決于方法驗(yàn)證的數(shù)據(jù)是否符合定量分析的要求,。

3-4 LC-MS/MS法的前處理方法引入了固相萃取法凈化,，一次前處理操作,、一次進(jìn)針分析10種真菌毒素，這為提高效率,、節(jié)約時(shí)間人力物力成本指明了優(yōu)化方向,。

3-5 基于LC-MS/MS法，FaTEx-gen固相萃取柱不用活化平衡,、淋洗洗脫,，樣品萃取溶液一步通過SPE柱后，填料保留雜質(zhì),，即得目標(biāo)物上機(jī)分析,。

4、 FaTEx-gen多真菌毒素一步法凈化柱操作步驟（10多種真菌毒素）

稱取2g樣品,，添加一定體積的酸化乙腈溶液,，震蕩30min,，離心10分鐘，取一定體積的上清液加入FaTEx-gen,，以每秒1滴的速度流出,，氮吹轉(zhuǎn)溶后上機(jī)到LC-MS/MS分析。

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