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ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,，并保持其免疫學(xué)活性；
（2）抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性,；
（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在,，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果,。
ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù),，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病,、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定,，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果,，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異,、簡(jiǎn)單,、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn),。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查,，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查,。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體,，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法,。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,，可概括四個(gè)方面： 1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位,。 2,、研究抗酶抗體的合成。 3,、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng),。 4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份,。
| 方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml,。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜,。次日,，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次,，每次3分鐘,。（簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同）,。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌,。（同時(shí)做空白孔,，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。 3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml,。37℃孵育0.5～1小時(shí),，洗滌。 4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,，37℃10～30分鐘,。 5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 結(jié)果判定：可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”,、“-”號(hào)表示,。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色,，則410nm）處,，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,，即為陽(yáng)性,。 |
方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml,，4℃過(guò)夜,。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌,。（同時(shí)做空白,、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）
↓
于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml,，37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。
↓
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4,、5,、6。
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml,，4℃過(guò)夜,。次日洗滌3次。
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加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌,。（同時(shí)做空白,、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）
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于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml,，37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。
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其余步驟同“雙抗體夾心法”的4,、5,、6。
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