內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法

  一,、內(nèi)標(biāo)法

  什么叫內(nèi)標(biāo)法?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物?

  內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法,。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響,，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度,。

  內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí),，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾,，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值,，即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí),，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作,。理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物,，這樣它能以準(zhǔn)確,、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)（如化學(xué)結(jié)構(gòu),、極性,、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等）、色譜行為和響應(yīng)特征,，是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物,。當(dāng)然，在色譜分析條什下,，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離,。需要指出的是，在少數(shù)情況下,，分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過(guò)程中所得到的回收率,，此時(shí)，他可以使用一種在這種過(guò)程中很容易被*回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo),，來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率,，而不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。

  在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí),，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?

  影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的,、色譜方面的和儀器方面的三類(lèi)。

  由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn),。

  化學(xué)方面的因素包括：

  1,、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好;

  2,、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，

  3,、內(nèi)標(biāo)物純度可變等,。

  對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)，色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些,，色譜上常見(jiàn)的一些問(wèn)題（如滲漏）對(duì)面積的影響比較大,，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度,，那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在,，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別,，檢測(cè)器非線(xiàn)性等,。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和,。如果認(rèn)為方法比較可靠,，而色譜固看來(lái)也是正常的話(huà)，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置,、斜率和峰寬定位,。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的zui有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定,，

  在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)應(yīng)注意什么?

  在用內(nèi)標(biāo)法做色話(huà)定量分析時(shí),，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積,，做重量比和面積比的關(guān)系曲線(xiàn),，此曲線(xiàn)即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)所用的條件一致,，因此,，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，不僅要注明色譜條件（如固定相,、柱溫,、載氣流速等），還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度,。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，各點(diǎn)并不*落在直線(xiàn)上,，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差,，在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2,，曲線(xiàn)仍可使用,，若大于2,，則應(yīng)重作曲線(xiàn)，如果曲線(xiàn)在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng),，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量,。

  二、外標(biāo)法

  用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì),，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱(chēng)為外標(biāo)法,。此法可分為工作曲線(xiàn)法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線(xiàn)法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線(xiàn),，求出斜率,、截距。在*相同的條件下,，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液,，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其濃度,，或用回歸方程計(jì)算,，工作曲線(xiàn)法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零,，若不等于零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差,。工作曲線(xiàn)的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法（直接比較法）定量,。

  外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i組分的含量,。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值,，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：

  W=A（W）/（A）

  式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積,。（W）及

  （A）分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便,，不需用校正因子,，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量,。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響,。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差,，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近,。

  外標(biāo)法 external standard method

  色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中,，而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定,，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近,，以利于定量分析的準(zhǔn)確性,。

  三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法（來(lái)源：藥物分析網(wǎng)）

  選一與欲測(cè)組分相近但能*分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒(méi)有的組分）,，然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中,，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù),。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。

  內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物,，加入到準(zhǔn)確稱(chēng)量的試樣中,，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量,。

  選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì);2.它必須*溶于試樣中,，并與試樣中各組分的色譜峰能*分離;3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分;4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間,。

  內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確,，由于通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差,。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩,，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱(chēng)量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難,。

  外標(biāo)法簡(jiǎn)便,，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行,，否則造成分析誤差,，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。

  內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已,，至于哪一種方法好與不好不能一概而論,，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求,，再加上分析成本分析效率等等問(wèn)題,，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿(mǎn)足要求才是zui重要的。

  2,、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候,，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD都滿(mǎn)足1.5%的要求時(shí),，也分為兩種情況,，小于1%和大于1%小于1.5%,。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個(gè)方法就沒(méi)有什么可以懷疑的了;如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí),，這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證,，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了,，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近,，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了,，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大,，只能用內(nèi)標(biāo)了,，或者干脆將原方法做大的變動(dòng)，再?lài)L試用外標(biāo)法測(cè)試,。

  3,、而對(duì)于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析,、環(huán)境分析等,，根據(jù)不同的*要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高,，這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間,。

  4、單從精密度方面去考慮,，排除其它成本和效率的因素,，個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過(guò)一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析,，以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo),，RTX-5

  amine（堿改性）

  結(jié)論：應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿(mǎn)足要求，還是外標(biāo)法了,，畢竟簡(jiǎn)單而省事,。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響,、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下,，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。無(wú)論應(yīng)用那種方法,，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的,，只要是按照程序經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的