慢病毒是一種有包膜的RNA病毒,直徑為80-120nm,,呈二十面體對稱結(jié)構(gòu),、球形,。病毒顆粒最外層是包膜(包膜蛋白決定了感染細胞的類型),,再往里依次為基質(zhì)蛋白和衣殼,,里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶,、整合酶和蛋白酶)。
慢病毒(Lentivirus)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,,基因組為雙鏈RNA,。但區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒,慢病毒具有更廣的宿主范圍,,對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力,。
重組慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I 型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的工具載體,其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源目的基因所取代,,屬于假型病毒(一次性感染能力而無復制產(chǎn)生新病毒能力),。將靶基因隨機整合到宿主的基因組中,并且能夠在細胞系中穩(wěn)定表達若干代,,可以進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選,。被廣泛應用于各種細胞系基因敲除、基因過表達,、RNA干擾,。
在轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)到細胞基因組中的工作中,重組慢病毒載體是一個強大和有效的工具,,基本操作規(guī)范如下:
1. 在實驗室工作時,,任何時候都必須穿著連體衣、隔離服或工作服,;應戴上合適的手套和口罩,。
2. 病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通的超凈工作臺操作病毒,,請不要打開風機,。
3. 所有的技術(shù)操作要按盡量減少氣溶膠和微小液滴形成的方式來進行。如果出現(xiàn)病毒污染,,請立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干凈,。
4. 如需離心,應使用密封性好的離心管,可用 Parafilm 膜封口后離心,,而且最好使用組織或細胞培養(yǎng)室內(nèi)的離心機,。
5. 用顯微鏡觀察細胞感染情況時用遵從以下步驟:擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板,并在使用70%乙醇清理所有受到污染的材料,、標本和培養(yǎng)物在廢棄或清潔再利用之前,,必須清除污染。廢棄的含病毒的培養(yǎng)基加入84消毒液(1:20左右),,浸泡一天后丟棄,。接觸過病毒的槍頭,離心管,,培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理,,也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌(121℃,30min),。
6. 手套用完后,,應先消毒再摘除,隨后必須洗手,。
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