01背景

這篇文竟是關(guān)于拉曼自動(dòng)化反饋控制多種補(bǔ)料成分以實(shí)現(xiàn)高接種密度增強(qiáng)型fed-batch平臺(tái)過程的研究論文,。該研究旨在開發(fā)控制策略,，通過在線拉曼光譜法監(jiān)測和調(diào)整代謝物濃度,，以實(shí)現(xiàn)高接種密度下的細(xì)胞培養(yǎng)過程中的高產(chǎn)量和穩(wěn)定性,。具體使用了增強(qiáng)型high inoculation density (HID)高接種密度培養(yǎng)fed-batch平臺(tái)過程來培養(yǎng)五個(gè)不同谷氨酰胺合成酶piggyBac®中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO克隆。通過在線拉曼光譜法連續(xù)監(jiān)測殘余glucose葡萄糖,、phenylalanine苯丙氨酸和methionine 甲硫氨酸的濃度變化,，開發(fā)了partial least squares models偏最小二乘模型。通過持續(xù)監(jiān)測殘余代謝物濃度,，自動(dòng)調(diào)整三種補(bǔ)充成分的補(bǔ)料速率,，從而保持葡萄糖、苯丙氨酸和甲硫氨酸在期望的設(shè)定點(diǎn)上,，并確保其他營養(yǎng)物質(zhì)濃度在所有培養(yǎng)的克隆中保持在可接受的水平,。

02材料與設(shè)備

細(xì)胞系與培養(yǎng)

使用了Lonza HID平臺(tái)的 GS piggyBac® CHO clones細(xì)胞系，共有5個(gè)克隆體,。采用了100*10⁵的初始接種密度,，在1L或者5L的體積進(jìn)行培養(yǎng)。

模型建立

使用了SIMCA v16分別對glucose, phenylalanine and methionine進(jìn)行建模處理,。首先是光譜區(qū)域的選擇,，主要是基于了在純水中他們各自的特征光譜范圍。其次,，通過 first derivative, Savitzky-Golay smoothing and standard normalvariate normalization (SNV) 的方法對原始光譜進(jìn)行了預(yù)處理,。建立的模型結(jié)果如Table 1所示。

參考已知的文獻(xiàn)并結(jié)合所建模型的R²以及root mean squared error of estimation and cross-validation (RMSEE/RMSECV) ,，初步判斷模型可用,。分對于glucose, phenylalanine, and methionine，如果RMSEPs 是 < 1 g/L, 100 mg/L and 100 mg/L，則判斷結(jié)果模型結(jié)果是可用的,。

03光譜采集與樣品分析

在線拉曼光譜的收集使用了來自于Endress +Hauser的RXN2 system系列,，有著 785 nm的光源并內(nèi)置了Runtime 6.2的操作系統(tǒng)。探頭使用了220 mm和420mm（分別在1L和5L的培養(yǎng)體積）的BioOptic探頭,。采用了5sx150 scan的曝光時(shí)間和曝光次數(shù),，總時(shí)長大約是12.5min。對于glucose, phenylalanine和methionine在線監(jiān)測數(shù)據(jù),，首先通過OPC的方式傳輸?shù)?strong>Delta-V(Emerson),，再在Delta-V對三個(gè)參數(shù)分別建立基于PID算法和on–off的控制回路，在監(jiān)測值低于目標(biāo)值的時(shí)候,，可以自動(dòng)添加SF1, SF2和 SF3,。SF1, SF2, and SF3對別對應(yīng)了glucose, phenylalanine and methionine的補(bǔ)料。

離線的樣品是每日從HID的培養(yǎng)中取出送樣檢測,。使用了來自于Nova Biomedical的Bioprofile FLEX2分化分析儀,。對于氨基酸以及最后產(chǎn)物的分析分別使用了high-performanceliquid chromatography (HPLC)和Tridex Protein Analyzer (IdexHealth Sciences)

04結(jié)果


 

上訴三個(gè)圖分別為glucose, phenylalanine和methionine的自動(dòng)控制情況以及SF1, SF2, and SF3在5個(gè)clones分別的添加總量。glucose的平均RMSEP是0.49 g/L (limit < 1 g/L), phenylalanine的平均RMSEP是40.72 mg/L (limit 100 mg/L) ,methionine的平均RMSEP是42.01 mg/L (limit 100 mg/L),，都是在可以接受的標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)的,。

除此之外，文章還對其他的組分進(jìn)行了監(jiān)測,，以探究在HID平臺(tái)的自動(dòng)回路控制培養(yǎng)模式對細(xì)胞生長代謝的影響,。具體對比了培養(yǎng)體系中的histidine組氨酸、leucine亮氨酸,、threonine蘇氨酸和ryptophan色氨酸的變化,，以評估拉曼自動(dòng)回路控制對殘留氨基酸濃度的影響。

可以看出,，利用拉曼自動(dòng)回路控制的方式,，通過動(dòng)態(tài)提供培養(yǎng)物所需的氨基酸，有助于降低克隆間代謝的差異性,。

此外,，為了進(jìn)一步驗(yàn)證拉曼自動(dòng)控制的HID培養(yǎng)的效果,，研究人員通過Peak VCC,、Harvest VCC、 Harvest viability,、Harvest lactate,、Harvest NH₄、Harvest product concentration六個(gè)維度來評估對細(xì)胞生長和產(chǎn)量的實(shí)際影響,?？梢钥闯觯贖ID平臺(tái)上培養(yǎng)的所有克隆均獲得較高的Peak VCC(320.5±32.3×10⁵) cells/ mL)，且直到收獲當(dāng)天,，大多數(shù)HID培養(yǎng)保持在以上200.0×10⁵ cells/mL(4/5clones),。總的來說,，除2 clone號(hào)外,，在HID工藝上培養(yǎng)的所有克隆在收獲時(shí)都有很高的活力(2clone的收獲活力較低，是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)結(jié)束時(shí)無意添加了堿基,，導(dǎo)致VCC下降),。除2 clone，收獲時(shí)培養(yǎng)存活率均大于85%,。

在HID培養(yǎng)過程中使用的自動(dòng)培養(yǎng)策略的另一個(gè)好處是代謝副產(chǎn)物的低水平,。乳酸和銨是代謝副產(chǎn)物，其積累與抑制細(xì)胞生長有關(guān),?？傮w而言，在HID工藝下培養(yǎng)的所有克隆的平均乳酸收獲濃度(0.8±0.5 g/L)和銨收獲濃度(0.07±0.02 g/L)均較低,，這表明以該種控制策略培養(yǎng),，不僅對氨基酸副產(chǎn)物的積累影響很小，而且對其他常見抑制副產(chǎn)物的積累影響也很小,。

最后,，本研究使用的5個(gè)clone在HID培養(yǎng)過程中獲得了較高的收獲產(chǎn)物濃度(6.5±1.2 g/L)。相比之下,，本研究中獲得的收獲產(chǎn)物濃度平均略高于之前所報(bào)道的(6.5±1.2 g/L),。也可以得出結(jié)論，在本研究中觀察到的較高的產(chǎn)品濃度,，部分原因是由于提出的自動(dòng)化策略可以維持高接種密度培養(yǎng)的營養(yǎng)需求,，從而實(shí)現(xiàn)所需要補(bǔ)料操作的自動(dòng)化，減少了危險(xiǎn)副產(chǎn)品的積累,。

05結(jié)論

該研究通過應(yīng)用在線拉曼監(jiān)控技術(shù)和自動(dòng)化反饋控制策略,，實(shí)現(xiàn)了高接種密度下的增強(qiáng)型細(xì)胞培養(yǎng)過程的穩(wěn)定和高產(chǎn)量。這為生物制藥行業(yè)開發(fā)更高效,、成本更低的生產(chǎn)過程提供了新的思路和方法,。

Webster, T.A., Hadley, B.C., Dickson, M., Hodgkins, J., Olin, M., Wolnick, N., Armstrong, J., Mason, C. & Downey, B. 2023, "Automated Raman feed-back control of multiple supplemental feeds to enable an intensified high inoculation density fed-batch platform process", Bioprocess and biosystems engineering